膀胱癌（BCa）是全球第二常见的泌尿系统恶性肿瘤，预后较差，早期诊断和治疗对改善患者结局至关重要。目前，膀胱镜检查是BCa诊断的主要方法，但其侵入性可能导致患者依从性低和严重并发症。替代的非侵入性方法，如尿液细胞学、NMP22和荧光原位杂交（FISH）检测，对早期BCa的诊断灵敏度不足。因此，开发有效的非侵入性生物标志物迫在眉睫。外泌体是细胞释放的直径约30-200nm的小囊泡，其内容物（如mRNA、蛋白质）受保护免于降解，能反映膀胱组织的分子过程。

尿液外泌体在BCa早期诊断中潜力巨大，但从复杂生物介质（尤其血尿样本）中高效分离外泌体仍面临挑战。现有分离技术（如超速离心、尺寸排阻色谱）存在操作繁琐、效率低、纯度差和设备依赖等局限。亲和捕获法（如使用抗体或适体修饰的固相材料）虽操作简便，但非均相反应限制捕获效率。均相反应具有快速结合动力学，可提高捕获效率。温度响应聚合物聚（N-异丙基丙烯酰胺）（PNIPAM）在低于临界溶液温度（LCST）时均相分散，高于LCST时聚集，便于分离。本研究将CD63适体修饰到PNIPAM上，开发功能化温度响应聚合物（PNIPAM-CD63），实现外泌体的均相捕获和异相分离，并结合外泌体RNA标志物构建诊断模型，旨在提升BCa早期检测性能。该方法无需超速离心，5分钟内即可完成外泌体富集，为临床转化提供新策略。

研究内容

图1.PNIPAM-CD63和标准外泌体的制备及表征。

本研究成功制备了功能化温度响应聚合物PNIPAM-CD63。通过将丙烯酸酯修饰的CD63适体与NIPAM单体聚合，验证了适体与聚合物的耦合：UV-vis光谱显示PNIPAM-CD63在260nm处出现适体特征吸收峰，荧光成像证实FAM标记的适体发出绿色荧光。差示扫描量热法（DSC）表明PNIPAM-CD63的LCST为32-33°C，与未修饰PNIPAM一致，且温度高于LCST时溶液变为乳白色凝胶，保留温度响应特性。此外，通过超速离心从5637BCa细胞系分离标准外泌体，透射电镜（TEM）显示典型杯状形态，纳米颗粒跟踪分析（NTA）表明尺寸主要分布在70-200nm（平均140nm），Westernblot验证外泌体阳性标志物（CD63、TSG101、CD81、CD9）表达，而阴性标志物钙联接蛋白仅存在于亲本细胞，证实外泌体完整性和高纯度。该部分为后续外泌体富集方法开发奠定基础。

图2.基于温度响应性聚合物的外泌体均相捕获方法的开发和优化

本研究验证了PNIPAM-CD63在均相条件下高效富集外泌体的能力。荧光显微镜观察显示，低于LCST时，FAM标记的PNIPAM-CD63均相分散（绿色荧光），与PKH26标记的外泌体（红色荧光）良好接触；高于LCST时，绿色荧光聚集并与红色荧光重叠，表明温度触发捕获。对比PNIPAM和PNIPAM-CD63，后者富集产物显示明显红色荧光，Westernblot检测到外泌体标志物（CD63、TSG101等），而PNIPAM组无信号，证明捕获依赖CD63适体特异性结合。扫描电镜（SEM）和TEM进一步证实外泌体完整附着于聚合物。通过优化反应时间（40分钟达平衡）和PNIPAM-CD63浓度（200nM为最佳），建立快速富集流程（1小时内完成）。该方法利用温度响应实现均相捕获和异相分离，提升效率且无需复杂设备。

图3.BCa相关外泌体RNA的鉴定和单细胞溯源分析

通过生物信息学和实验验证识别BCa相关外泌体RNA标志物。基于TCGA、GEO数据集（GSE13507、GSE37815）和ExoCarta数据库，筛选出12个在BCa中上调的外泌体RNA，其中5个（TUBA1C、TUBB、MIF、LSR、RCC2）在患者尿液外泌体中高表达。小队列（n=65）验证显示LSR、RCC2和TUBB在BCa患者中显著高于良性泌尿疾病（UD）患者。单细胞RNA测序分析8个BCa和3个癌旁样本，鉴定了9个细胞簇，上皮细胞显示高异质性且主要源于肿瘤。LSR和TUBB在肿瘤细胞中高表达，LSR特异性富集于肿瘤细胞，功能分析表明LSR参与上皮-间质转化（EMT），RCC2和TUBB涉及细胞周期和增殖，三者可能通过MTOR通路协同作用。这些标志物为诊断模型提供基础。

图4.基于尿外泌体的膀胱癌多中心临床队列诊断模型的构建和验证

基于外泌体RNA标志物构建诊断模型。在训练队列（185例BCa、81例UD）中，通过逻辑回归分析比较LSR、RCC2和TUBB组合，确定LSR和TUBB构成的模型（UExo-2R）性能最优，AUC为0.9（95%CI:0.846–0.940）。模型公式为：评分=-2.598+0.86LSR+1.202TUBB，cutoff值0.688。在测试队列中，UExo-2R的AUC为0.856（95%CI:0.765–0.922）。独立验证队列（55例BCa、32例UD）进一步证实AUC为0.87（95%CI:0.781–0.932）。UExo-2R评分与BCa分期、分级和浸润程度正相关，有助于临床决策避免漏诊。

图5.UExo-2R和FISH对BCa诊断性能的比较

对比UExo-2R与FISH的诊断性能。在79例BCa患者中，UExo-2R的灵敏度（91.1%）显著高于FISH（53.2%），且检出37%的FISH阴性病例。对于低分级BCa，UExo-2R灵敏度为82.6%（FISH仅26.1%）；对于早期BCa，UExo-2R灵敏度为88.7%（FISH为49.1%）。联合UExo-2R和FISH可将灵敏度提升至94.3%。术后UExo-2R评分显著下降，表明其可用于动态监测疾病状态。UExo-2R在早期和低分级BCa检测中优势突出，弥补传统方法不足。

 本研究开发了一种基于功能化温度响应聚合物（PNIPAM-CD63）的外泌体富集方法，通过均相捕获和异相分离，实现了尿液外泌体的高效、快速（5分钟内）富集，无需超速离心等复杂设备。该方法成本低、操作简便，适用于临床批量样本。通过筛选外泌体RNA标志物，构建了诊断模型UExo-2R（基于LSR和TUBB），在训练、测试和独立验证队列中均表现出色（AUC>0.85），显著优于FISH，尤其对低分级和早期BCa灵敏度高（分别达82.6%和88.7%）。单细胞分析证实标志物源于肿瘤细胞，涉及EMT和细胞周期通路。UExo-2R评分与肿瘤进展正相关，术后评分下降，显示动态监测潜力。尽管机制和长期预后需进一步研究，但该方法为BCa早期诊断提供了非侵入性、高灵敏度工具，具有重要临床转化价值。未来可开发集成富集与检测的平台，提升应用便捷性。

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.cej.2024.151304