基于纳米结构Co₃O₄-CuO@MWCNTs功能化平台的微生物毒素无标记免疫传感检测

1.引言

微生物感染致高死亡率与发病率，食水传播病原体是主因。金黄色葡萄球菌作为革兰氏阳性致病菌，分泌的α-溶血素（Hla）会形成跨膜孔破坏宿主细胞膜，裂解多种哺乳动物细胞，危害极大。现有Hla检测方法有限，如分子印迹聚合物传感系统、红细胞伪装电化学传感器等，操作复杂或适用性窄。电化学免疫传感器虽有优势，但需优化电极修饰以提升性能，故研究构建AuNPs-Co₃O₄-CuO@MWCNTs纳米复合材料功能化免疫传感平台，实现Hla高效检测。

本研究通过化学合成钴铜双金属氧化物（Co₃O₄-CuO），与多壁碳纳米管（MWCNTs）、金纳米颗粒（AuNPs）整合形成纳米复合材料，修饰于一次性丝网印刷电极表面。通过α-硫辛酸（LPA）自组装单层实现抗α-溶血素抗体的稳定固定，构建无标记电化学免疫传感器，借助循环伏安法（CV）和电化学阻抗谱（EIS）实现毒素检测，同时优化实验参数以满足食品样本中痕量毒素的定量分析需求。

方案一：Hla纳米免疫传感器芯片的制备步骤示意图

2.结果与讨论

纳米材料的结构和形貌表征：通过FTIR、XRD、TEM和拉曼光谱表征，Co₃O₄为尖晶石结构（特征峰612、502cm⁻¹）、球形（48±5.0nm），CuO为晶态（特征峰668、567cm⁻¹）、纳米立方体（22±4.0nm），AuNPs直径13±3.0nm，MWCNTs直径9.5nm，各组分分散均匀，且MWCNTs与双金属氧化物间存在电荷转移，结构稳定。

图1：A化学合成的纳米材料的傅里叶变换红外光谱，展示了各个组分（碳纳米管、Co₃O₄和CuO）的特征振动吸收带、混合双金属氧化物（Co₃O₄-CuO）以及整个纳米复合材料（Co₃O₄-CuO@MWCNTs）的吸收带。B MWCNTs、Co₃O₄、CuO、Co₃O₄-CuO和Co₃O₄-CuO@MWCNTs纳米复合材料的晶体学粉末图谱（XRD）。C (I)Co₃O₄-CuO、(II)、(III)AuNPs和(IV)AuNPs-Co₃O₄-CuO@MWCNTs的透射电子显微镜图像。D (I)在与双金属氧化物（Co₃O₄-CuO）混合之前的多壁碳纳米管（MWCNTs）的拉曼光谱。(II)Co₃O₄-CuO的混合物。(III)与Co₃O₄-CuO@MWCNTs纳米复合材料结合后的碳纳米管。

传感器芯片的电化学表征：优化Co₃O₄:CuO=80:20时，电极电荷转移电阻最低（75Ω）、伏安信号最高；加入MWCNTs提升电子传导效率，AuNPs浓度3.0μL（58ppm）时抗体固定最佳；修饰后电极电化学活性表面积达0.15cm²，远高于未修饰电极的0.02cm²。

图2：A 一种伏安法（左侧）和阻抗法（右侧）性能的丝网印刷电极，其上修饰了不同比例的Co₃O₄-CuO纳米复合材料。实验在5.0mM的[Fe(CN)₆]⁻/⁺作为标准氧化还原探针的溶液中进行。B 丝网印刷电极上修饰了与不同浓度的多壁碳纳米管（MWCNTs）偶联的Co₃O₄-CuO金属氧化物纳米粒子杂质的循环伏安法（CV）响应。测量在5.0mM[Fe(CN)₆]⁻/⁺溶液作为标准氧化还原探针的溶液中进行。C 丝网印刷电极上修饰了与不同浓度的多壁碳纳米管（MWCNTs）偶联的Co₃O₄-CuO金属氧化物纳米粒子杂质的电化学阻抗谱（Nyquist图）响应。测量在5.0mM[Fe(CN)₆]⁻/⁺溶液作为标准氧化还原探针的溶液中进行。D 金纳米粒子（AuNP）掺入纳米复合材料基质中对抗体在传感器表面固定化的影响。循环伏安法（左）和EIS（右）响应，展示经过完全纳米复合材料（AuNPs-Co₃O₄-CuO@MWCNTs）修饰的丝网印刷电极在不同AuNP浓度下的表现。

α-溶血素免疫传感芯片的构建：以α-硫辛酸（LPA）自组装单层固定抗α-溶血素抗体，通过CV和EIS监测构建过程，抗体表面覆盖率达92%；优化后抗体浓度40μg/mL、孵育时间15min、检测pH7.4，确保传感器性能稳定、背景干扰小。

图3：A 使用CV（左侧）和EIS（右侧）跟踪免疫传感器制备过程中表面界面发生的电化学氧化还原反应。电化学测量在 [Fe₃(CN)₆]^3/4− 和0.1M KCl中进行。B 传感器芯片在打印纳米结构电极上固定抗体前后（左侧）的奈奎斯特图和表面覆盖分析（右侧）。C SEM图像和EDS/EDX分析用于识别改性传感器表面的形貌和元素组成。传感器芯片的SEM图像：（I）AuNPs-Co₃O₄-CuO@MWCNTs，(II)LPA@AuNPs-Co₃O₄-CuO@MWCNTs，以及（III）Ab@LPA@AuNPs-Co₃O₄-CuO@MWCNTs。（IV）Ab@LPA@AuNPs-Co₃O₄-CuO@MWCNTs的表面元素分析。

施加直流电势的影响：在0.0-0.9V范围内评估施加直流极化电势对EIS响应的影响，结果显示增大电势可降低电荷转移电阻与Warburg扩散组分，提升对抗原捕获诱导电阻变化的灵敏度，最终选择0.9V以抑制背景干扰、保证检测准确性。

图4：A直流电势对Hla免疫传感器的阻抗性能的影响。电化学阻抗谱（EIS）测量在5.0µg/mLα-溶血素中进行。B不同AuNP浓度下Hla免疫传感器的EIS响应。测量在5.0-µg/mLα-溶血素中进行。C不同抗体负载浓度下Hla免疫传感器的EIS响应。测量在5.0-µg/mLα-溶血素中进行。D识别时间对Hla免疫传感器EIS响应的影响。测量在5.0-µg/mLα-溶血素中进行。E磷酸盐缓冲液pH值对Hla生物传感器EIS响应的影响。测量在5.0-µg/mLα-溶血素中进行。

标准校准曲线：优化条件下，传感器对α-溶血素的检测动态范围为0.000001-0.05mg/mL，检出限低至0.01ng/mL，相关系数（R²）为0.991，无需样本稀释或富集，可直接用于实际样本中痕量毒素分析。

图5：A 不同α-溶血素浓度下Hla免疫传感器的奈奎斯特图。测量在0.9V下进行，频率范围为0.1Hz-100kHz，扰动为10mV。插图显示了用于数据拟合的兰德斯等效电路。B 校准曲线显示了α-溶血素浓度与相应的Rct值变化之间的线性关系。

选择性测试：以抗坏血酸、葡萄糖、脂多糖等为干扰物，测试传感器选择性，结果显示仅α-溶血素能使电荷转移电阻（Rct）显著升高，干扰物无明显响应，证实传感器对目标毒素具有高特异性识别能力。

图6：A Hla生物传感器对非目标分子的选择性，包括抗坏血酸（AA）、尿酸（UA）、葡萄糖、多巴胺、L-半胱氨酸、过氧化氢、脂多糖（LPS）和蛋白A。α溶血素（200ng/mL）单独测试和混合物测试作为阳性对照。B 从芯片制造开始，测试传感器的使用寿命长达八周。C 对新开发的免疫传感器芯片进行重现性测试。

3.总结

本研究开发了基于AuNPs-Co₃O₄-CuO@MWCNTs纳米复合材料的无标记电化学免疫传感器，用于食品样本中α-溶血素的快速检测。通过化学合成与表征验证了纳米复合材料的结构稳定性和电化学活性，系统优化了传感器构建与检测的关键参数。该传感器具有检出限低（0.01ng/mL）、选择性强、稳定性好等优势，且检测过程无需标记、操作简便，适用于现场快速筛查。在多种食品样本中的高回收率结果，证实了其实际应用价值，为食品安全领域微生物毒素检测提供了新的技术方案。

论文链接：https://doi.org/10.1007/s42114-025-01472-1