地表水和废水中碳青霉烯类耐药铜绿假单胞菌的检测方法

原创

来源：牛婧媛

2025-12-19 16:03:01

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核心提示：基于水环境样本（地表水与废水），通过系统优化培养基、富集步骤及抗生素添加策略的实验，实现了高特异性检测碳青霉烯类耐药铜绿假单胞菌（CRPA）的方法。实验确定了亚硫酸铵脯氨酸肉汤联合万古霉素富集后，在M-PA-C琼脂添加亚胺培南（8 mg/L）的选择性培养最优，显著降低背景菌干扰（PPV达80–100%），并建立低至3.91 CFU的检测限。该方法填补了环境水体CRPA标准化检测的空白，对全球耐药性环境传播监测及公共卫生风险防控具有重要应用价值。

1.引言

水体作为铜绿假单胞菌的重要储存库，普遍存在该菌污染，其形成的生物膜难以清除，且耐药性问题日益严峻，特别是碳青霉烯类耐药铜绿假单胞菌（CRPA），被世界卫生组织列为高优先级病原体，可引发难治性感染。然而，现有检测方法多针对临床样本，缺乏适用于水体的标准化方案，且传统ISO方法存在灵敏度低、耗时长、选择性差等问题。因此，开发一种高效、特异的CRPA水体检测方法，对环境监测和公共卫生防控至关重要。

本研究开发了针对水体中碳青霉烯类耐药铜绿假单胞菌（CRPA）的标准化检测技术，通过系统优化培养基组合、富集策略及抗生素添加方式解决了传统方法背景干扰大、特异性差的问题。实验采用膜过滤浓缩水样后，比较四种选择性培养基（M-PA-C、CHROMagar等）在添加亚胺培南（8 mg/L）、美罗培南等抗生素下的菌株回收率，结合非选择性富集（天冬酰胺脯氨酸肉汤+万古霉素）与选择性平板培养（添加亚胺培南），显著提升CRPA检出率。通过加标地表水与天然污染废水样本验证，该方法将背景菌抑制的阳性预测值（PPV）提升至80–100%，检测限低至3.91 CFU，解决了环境水体CRPA监测灵敏度不足的瓶颈，为耐药性传播追踪提供了可靠工具。

2.结果与讨论

选择性培养基上CRPA菌落形态：展示了7株特征明确的CRPA在四种培养基（CN琼脂、M-PA-C、CHROMagar、mZ琼脂）补充亚胺培南后的菌落表型。M-PA-C和CHROMagar能清晰显示典型菌落形态（如M-PA-C的粉红色菌落、CHROMagar的蓝绿色菌落），而mZ琼脂因菌落透明度高导致识别困难。值得注意的是，CN琼脂中部分菌株（如Strain 2、3）在亚胺培南存在下生长受抑制。

图 1 菌株4在不同琼脂平板上的形态学，含亚米佩南（A： M-PA-C;B：克罗玛加尔;C：CN琼脂;D：mZ-琼脂）。

地表水加标样品直接平板的菌落变化：对比了CRPA菌株在地表水直接过滤培养后的形态变化。所有菌株在M-PA-C上呈粉红色典型菌落，但在CHROMagar上出现色素褪变（蓝绿色菌落变为棕灰色透明），且Strain 6在含头孢他啶的培养基中生长不良。未加标样品中，非选择性TSA平板背景菌落>100，而选择性平板背景显著降低。

图 2 地表水（100 mL）在M-PA-C（A）上加入了Strain 5（100 CFU）和CHROMagar（B）与亚米佩南。

废水样品直接平板的假阳性现象：揭示了废水直接平板的鉴定误差问题。在M-PA-C+亚胺培南平板上，CRPA呈黄褐色菌落（箭头所示），而CHROMagar的蓝色菌落经质谱鉴定均为 Aeromonas caviae 等非铜绿假单胞菌（假阳性率100%）。该结果说明直接平板难以区分表型相似的环境菌。

图 3 使用3毫升废水样本，使用亚美南（IMIPENEM）在M-PA-C（A）和CHROMagar（B）上建立菌落。在这块特定的M-PA-C板上，有1株抗碳青霉烯的铜绿假单胞菌（CRPA;用箭头标记）。在CHROMagar上，即该特定板块，既未发现CRPA也未发现P. aeruginosa。CHROMagar上的所有蓝色殖民地都是其他物种。

废水背景菌的物种分布：通过MALDI-TOF质谱鉴定，统计了直接平板法中非目标菌的物种组成。Aeromonas spp.（占58%）和Pseudomonas oleovorans（占21%）是主要干扰菌，在CHROMagar上形成拟似CRPA的蓝色或绿色菌落，导致假阳性预测值（PPV）仅0-30%

图 4 在M-PA-C和CHROMagar废水直接镀层时，配合抗生素进行假阳性物种鉴定。

不同方法的菌种检出比例：量化比较了直接平板与富集法对目标菌（CRPA/CSPA）和非目标菌的分离效率。直接平板中非铜绿假单胞菌占比高达60-90%（如CHROMagar-美罗培南组），而富集法（ASP+万古霉素→M-PA-C+亚胺培南）将CRPA检出比例提升至73%，背景菌降至<10%。

图 5 在直接对M-PA-C和CHROMagar进行废水直接镀层时发现的所有疑似菌落的比例，以及加抗生素的假单胞菌和铜质假单胞菌的比例。CRPA：碳青霉烯耐药性铜绿假单胞菌;CSPA：对碳青霉烯敏感的铜绿假单胞菌。

3.总结

该研究建立了首个针对水环境中耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌（CRPA）的标准检测方法，其核心优势在于系统性优化与实际应用适配性。通过对比四种选择性培养基与多种抗生素组合，创新性采用“过滤浓缩→非选择性富集（ASP+万古霉素）→选择性平板（M-PA-C+亚胺培南）”三步流程，显著提升检测灵敏度（最低检出限达7.20×10² CFU）与特异性（PPV 73%）。方法有效抑制废水背景菌干扰（如 Aeromonas spp.），克服传统ISO方法耗时长、假阳性率高的缺陷。研究同步验证了亚胺培南（8 mg/L）作为最优选择剂，且明确富集步骤添加抗生素会降低检出率，为环境耐药菌监测提供了关键技术支持。