引言

血流感染（BSI）是病原体侵入血液引发的致命疾病，发病率高且死亡率随治疗延迟显著上升，快速精准诊断至关重要。常规血培养仅能检测可培养病原体，且耗时数天；基于 16S rRNA 基因的分子检测虽快速，但血液中大量人类 DNA 会与引物交叉反应，导致特异性和灵敏度不足。本研究通过优化 16S rRNA 基因 PCR 引物选择，规避与人类基因组的交叉反应，为存在丰富宿主 DNA 的 BSI 样本提供更高效的病原体检测方法。

结果与讨论

从 113 条靶向 16S rRNA 基因保守区的引物中，筛选出 7 条与人类基因组及转录本无相似性的引物，分别为 64F、363F、520F、530F、806R、1027R、1100R。

列出了 7 条引物的具体 5´-3´ 序列，为后续引物对组合及检测应用提供了明确的序列依据。

引物与人类基因组的 0% 相似性是避免交叉反应的基础，这一筛选标准直接针对分子检测中人类 DNA 干扰的核心问题。

明确的引物序列为方法可重复性提供保障，其他研究团队可直接引用该序列开展相关 BSI 检测优化研究。

该批引物经过熔解温度（正反向引物差异≤10℃）和片段大小（适配高通量测序或 Sanger 测序）筛选，兼顾特异性与实用性。

参考引物 341F 与所有反向引物（803、806、1027）组合，均出现细菌（大肠杆菌）和人类基因组双重阳性扩增（+/+），存在严重交叉反应。

1027R 与所有正向引物组合，同样产生双重阳性扩增，特异性极差。

优化引物组合 64–803、64–806、363–803、363–806、530–806 仅对大肠杆菌产生阳性扩增（+/-），不与人类基因组反应，特异性优异。

人类基因组与细菌基因组存在相似性，传统参考引物易引发交叉反应，这是导致分子检测假阳性的关键原因。

优化引物对通过规避与人类基因组的同源序列，从源头解决了特异性不足的问题，无需额外进行扩增子大小筛选，减少操作步骤与污染风险。

该结果在金黄色葡萄球菌、空肠弯曲杆菌基因组中得到重复验证，证明优化引物对的特异性具有普适性。

参考引物对 341–803、341–806 及 530–803 与人类基因组发生交叉反应，出现误扩增现象。

优化筛选的 64–803、64–806、363–803、363–806 引物对，仅特异性扩增大肠杆菌 DNA，不与人类基因组反应。

363–806 引物对虽产生次级 PCR 产物，但所有优化引物对均实现 16S rRNA 基因的特异性扩增。

优化引物对 363–803、64–803、64–806 灵敏度最高，最低可检测到 10⁻⁴浓度的大肠杆菌 DNA，线性相关性良好（R² 值 0.7372–0.9623）。

参考引物对 341–803 灵敏度最低，仅能检测到 10⁻² 浓度的大肠杆菌 DNA，且存在明显误扩增。

血清样本检测中，优化引物对未出现人类 DNA 扩增产物，进一步验证其抗干扰能力。

优化引物对 363–803、64–803、64–806 灵敏度最高，最低可检测到 10⁻⁴浓度的大肠杆菌 DNA，线性相关性良好（R² 值 0.7372–0.9623）。

参考引物对 341–803 灵敏度最低，仅能检测到 10⁻² 浓度的大肠杆菌 DNA，且存在明显误扩增。

血清样本检测中，优化引物对未出现人类 DNA 扩增产物，进一步验证其抗干扰能力。

本研究针对血流感染（BSI）细菌检测的核心痛点，优化了基于 16S rRNA 基因的 PCR 引物筛选方案，成功解决了血液中大量人类 DNA 干扰检测特异性和灵敏度的关键问题。

总结

背景与目标：BSI 病情凶险、需快速诊断，但常规血培养耗时久，传统 16S rRNA 基因分子检测易受人类 DNA 交叉反应影响。研究旨在筛选不与人类基因组反应、且高效扩增细菌 16S rRNA 基因的引物。

关键方法：从 113 条靶向 16S rRNA 基因保守区的引物中，通过序列相似性分析、熔解温度和片段大小筛选，获得 7 条与人类基因组无相似性的引物，并验证其特异性与灵敏度。

核心结果：64–803、64–806、363–803、363–806 等引物对可特异性扩增大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等细菌 DNA，不与人类基因组交叉反应；检测灵敏度达 10⁻⁴浓度，显著优于传统参考引物，且无需额外酶学处理或大小筛选。

研究价值与意义

该优化方案简化了检测流程、降低了成本与污染风险，适配高通量测序和 Sanger 测序等不同平台，为 BSI 及高人类 DNA 背景样本的快速精准检测提供了高效解决方案，有助于临床及时启动抗菌治疗、减少抗生素滥用与耐药性产生，具有重要的临床应用价值。

论文链接：https://doi.org/10.1371/journal.pone.0219086