空气中的细菌检测：使用游离抗体的比色检测进行物种特异性浓度测量

1.引言

监测空气中的细菌对公共健康、卫生及环保至关重要。生物气溶胶会影响室内空气质量，金黄色葡萄球菌和大肠杆菌可引发多种健康问题，在日常环境中普遍存在。

免疫比色法操作简便，适合细菌物种特异性定量，经典的 ELISA 技术却存在依赖操作技能、易出现假阳性、耗时久等局限。虽有研究用纳米颗粒标记抗体结合过滤改进，但低浓度空气细菌的灵敏检测仍需优化。

本研究提出过滤与 HRP 抗体偶联的新型比色法，结合气 - 液采样系统，通过酶催化放大信号，简化流程，实现空气中两类细菌的高效定量，为空气细菌快速精准监测提供新方案。

2.结果与讨论

如图 3 所示，目标细菌浓度与吸光度呈显著负相关。随着细菌浓度（10⁰-10⁷ CFU/mL）的对数增长，吸光度近似线性下降。这一趋势源于抗原 - 抗体结合的竞争机制：细菌浓度越高，与 Ab@HRP 结合形成的复合物越多，游离 Ab@HRP 数量越少，经 HRP 催化 TMB 反应生成的黄色化合物浓度越低，吸光度值随之降低。

基于空白样本吸光度标准差的 3 倍计算，大肠杆菌的 LOD 为 21.5 CFU/mL，金黄色葡萄球菌为 246 CFU/mL。该结果优于 Sung 等人采用金纳米颗粒标记的过滤比色法（金黄色葡萄球菌 LOD 1500 CFU/mL），且与近年报道的荧光适体传感器、碳纳米管场效应晶体管传感器等技术的检测限处于同一水平，验证了该方法在液体样本中检测的灵敏性。

如图 4 所示，经 SKC BioSampler 采集的气 - 液样本中，大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的 LOD 分别为 81.8 CFU/mL 和 143 CFU/mL。结合采样器 150,000 的富集比换算，空气中两类细菌的 LOD 分别为 545 CFU/m³ 和 953 CFU/m³，虽高于家庭、学校等真实环境中的细菌浓度（大肠杆菌 28.26-60.07 CFU/m³，金黄色葡萄球菌 4-140 CFU/m³），但在受控实验室环境中实现了有效定量。

对比液体样本与气 - 液样本的 LOD 差异发现：金黄色葡萄球菌气 - 液样本的 LOD（143 CFU/mL）低于液体样本（246 CFU/mL），这可能与气溶胶化后细菌进入活的非可培养（VBNC）状态有关。VBNC 状态的细菌仍能参与抗原 - 抗体反应，但无法在培养基上形成菌落，导致相同吸光度下可培养细菌数量减少，表现为 LOD 降低。

而大肠杆菌气 - 液样本的 LOD（81.8 CFU/mL）高于液体样本（21.5 CFU/mL），如图 9 所示，经动态光散射（DLS）检测，气 - 液采样后大肠杆菌的流体力学直径减少 46.7%，显著高于金黄色葡萄球菌的 14.5%。这是因为革兰氏阴性菌的外膜更脆弱，在采样过程的高流速流体冲击下易受损，影响过滤截留效率，导致检测灵敏度下降。

如图 5 所示，非目标菌（蜡样芽孢杆菌、表皮葡萄球菌）的吸光度显著高于目标菌（大肠杆菌、金黄色葡萄球菌），且混合样本中吸光度值与目标菌浓度对应。非目标菌的吸光度略低于空白样本，可能是其堵塞滤膜孔隙轻微影响了 Ab@HRP 的过滤效率，但所有非目标菌的吸光度均高于目标菌的 LOD，表明该方法对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌具有良好的物种特异性，不受常见杂菌干扰。

如图 6 所示，ELISA 方法对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的 LOD 分别为 16,178 CFU/mL 和 53,262 CFU/mL，远高于本研究提出的比色法。同时，比色法总检测时间仅 25 分钟，而 ELISA 需 4-6 小时（含过夜包被、封闭等步骤），体现出快速检测的显著优势。

如图 7 所示，比色法优于 ELISA 的关键在于：① 液体中抗原 - 抗体反应无细菌包被损失，参与反应的细菌数量更多；② 避免了细菌在固相表面吸附导致的变性，保留了完整抗原活性；③ 悬浮状态下细菌表面结合位点完全暴露，抗体结合效率更高；④ Ab@HRP 在溶液中自由扩散，与细菌的接触机会更充足；⑤ 无需封闭步骤，避免了牛血清白蛋白（BSA）对抗原位点的遮挡。

如图 8 所示，Ab@HRP 浓度显著影响检测灵敏度。当浓度为 1000 ng/mL 时，吸光度值几乎不随细菌浓度变化；200 ng/mL 时，吸光度在特定细菌浓度阈值后开始下降；40 ng/mL 时，从低浓度细菌开始就呈现明显的负相关斜率。这是因为低浓度 Ab@HRP 能减少游离抗体的 “冗余量”，即使少量细菌结合也能显著改变游离 Ab@HRP 比例，从而降低 LOD，为后续优化检测性能提供了关键方向。

如图 9 所示，通过动态光散射（DLS）检测液体培养样本与气 - 液采样样本的流体力学直径，发现两类细菌在采样后均出现尺寸缩减，但差异显著：大肠杆菌经 SKC BioSampler 采集后，直径减少 46.7%，而金黄色葡萄球菌仅减少 14.5%。

这一差异源于细菌细胞壁结构特性：大肠杆菌作为革兰氏阴性菌，外膜脆弱且机械强度低（破裂力仅为金黄色葡萄球菌的 1/3.6），在气 - 液采样的高流速流体冲击下易发生膜损伤甚至破裂；而金黄色葡萄球菌作为革兰氏阳性菌，细胞壁肽聚糖层较厚，机械稳定性更强，采样过程中形态损伤更小。

细菌形态损伤直接影响过滤效率：大肠杆菌因尺寸缩减，部分受损个体可能穿透 0.22μm 滤膜，导致细菌 - 抗体 - HRP 复合物截留不完全，游离 Ab@HRP 含量偏高，最终表现为气 - 液样本的 LOD（81.8 CFU/mL）高于液体样本（21.5 CFU/mL）；而金黄色葡萄球菌形态损伤轻微，过滤截留效率稳定，未出现明显的灵敏度下降，甚至因 VBNC 状态的影响使 LOD 略有降低。这一结果提示，针对革兰氏阴性菌的空气检测，需优化采样方式以减少机械损伤，提升过滤截留的准确性。

3.总结

本研究成功开发了一种基于过滤与 HRP 抗体偶联的新型比色检测方法，实现了对空气中大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的物种特异性浓度定量，核心成果与价值如下：

3.1 方法核心与性能表现

该方法以抗原 - 抗体反应为基础，结合膜过滤技术与 HRP 酶催化信号放大，通过检测游离 Ab@HRP 与 TMB 反应后的吸光度（450nm 波长）实现细菌定量，吸光度与细菌浓度呈负相关。在性能上，液体样本中大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的检测限分别达 21.5 CFU/mL 和 246 CFU/mL，结合气 - 液采样系统换算后，空气中两类细菌的检测限为 545 CFU/m³ 和 953 CFU/m³，特异性良好，对非目标菌交叉反应低。

3.2 关键优势

相较于传统 ELISA 方法，该方法具有显著优势：检测限更低（仅为 ELISA 的 1/750-1/217），检测时间大幅缩短（25 分钟 vs 4-6 小时），无需繁琐洗涤步骤，操作更简便。其核心优势源于液体环境中更充分的抗原 - 抗体反应 —— 无细菌包被损失、避免细菌变性、结合位点暴露更充分、抗体与细菌接触更高效，且无需封闭步骤遮挡抗原位点。

3.3 应用价值与优化方向

该方法适用于食品加工、医疗等场景的空气细菌快速监测，为空气质量评估与致病菌风险防控提供了高效工具。同时，研究揭示了气 - 液采样过程中细菌细胞壁特性对检测的影响：革兰氏阴性菌（大肠杆菌）因外膜脆弱易受损，可能降低过滤效率；金黄色葡萄球菌则因细胞壁坚韧，形态稳定性更强。未来可通过优化抗体亲和力、调整 Ab@HRP 浓度、采用信号放大策略，或改进气 - 液采样方式提升富集比，进一步降低检测限，以适配真实环境中更低浓度的空气细菌检测需求。

论文链接：https://doi.org/10.1016/j.jhazmat.2025.138761