近红外荧光探针：一针双测，同步感知pH与粘度变化

细胞内微环境参数（如pH和粘度）在信号转导、物质传输、细胞代谢和大分子相互作用等生理过程中扮演关键角色。pH失衡可能导致自由基生成、膜结构破坏和细胞异常凋亡，与阿尔茨海默病、癌症等疾病密切相关；粘度异常则与糖尿病、动脉粥样硬化等病理状态关联。传统检测方法如微电极法、酸碱指示剂和吸收光谱法存在操作复杂、灵敏度低或侵入性强等局限。荧光检测法虽具有成本低、操作简便和生物相容性高等优势，但现有探针多局限于单发射模式或可见光区域，易受背景荧光干扰且组织穿透性差。近红外（NIR, 650-900 nm）荧光探针因深层组织穿透、低光损伤和弱背景散射等特点成为理想选择，但同时检测pH和粘度的比率型NIR探针仍罕见。

本研究基于ICT机制设计了一种新型D-π-A结构探针NT，以羟基氧杂蒽为电子供体，苯并噻唑盐为电子受体，通过羟基去质子化实现pH响应性红移，并通过抑制扭转分子内电荷转移（TICT）过程响应粘度变化。NT具备优异水溶性和快速可逆响应能力，旨在解决现有技术无法同步、无损检测多参数的问题，为复杂生物和环境样本提供高精度解决方案。

研究内容

图1. NT的设计策略

NT探针采用羟基氧杂蒽（电子供体）与苯并噻唑盐（电子受体）构建D-π-A共轭体系。在酸性环境中，羟基未解离，ICT效应较弱，发射峰位于672 nm；在碱性环境中，羟基去质子化为氧负离子，增强给电子能力，导致发射红移至715 nm，实现比率型pH检测。同时，苯并噻唑盐结构作为粘度敏感转子：低粘度时C=C键自由旋转引发TICT过程，荧光淬灭；高粘度时旋转受限，TICT被抑制，荧光增强。该双重响应机制使NT无需化学修饰即可同步检测pH和粘度。

图2. 传感机制的设计策略

pH滴定实验表明，当pH从4.0升至11.0时，NT在672 nm处荧光强度逐渐降低，而715 nm处强度增加，等发射点位于700 nm。比率值（I672/I715）在pH 6.2-7.8范围内与pH线性相关（R²=0.993），pKa为6.95，适用于生物和环境样本的生理pH范围。紫外-可见光谱显示，pH升高导致558 nm和650 nm吸收峰降低，576 nm和692 nm新峰出现，验证去质子化过程。试纸实验直观显示颜色从浅黄加深至深红，支持裸眼检测。NT响应快速（<1分钟）、可逆（至少7次循环），且对常见生物分子、阴离子和阳离子抗干扰能力强，保证检测特异性。

图3. NT对粘度的响应

在PBS缓冲液中添加甘油（0-80%）以模拟不同粘度环境。随甘油比例增加，NT荧光强度显著增强（因TICT过程受抑制），且在pH 6.5和8.0下均呈现良好线性（pH 6.5: R²=0.997；pH 8.0: R²=0.999）。溶剂极性实验证明荧光增强仅由粘度变化引起，而非极性效应。此外，NT在粘度系统中仍保持pH响应能力，但高粘度（80%甘油）会略微降低pH灵敏度。食品增稠剂（果胶和黄原胶）测试中，NT荧光强度与增稠剂浓度线性相关，且黄原胶（中性）仅增强强度，而果胶（酸性）还引起蓝移，证实NT能区分粘度和pH贡献。

图4. 计算分子轨道

通过Gaussian 09程序计算NT和NT-OH的前沿分子轨道。NT-OH的能隙减小（3.95 eV vs. 4.20 eV）和偶极矩增大（21.92 D vs. 10.25 D）表明去质子化后ICT效应增强，导致发射红移，与实验光谱一致。电子云分布显示，NT中电子主要集中在氧杂蒽部分，而NT-OH中氧负离子区域电子云密度更高，验证了羟基作为pH响应位点的设计。

图5. NT在实际样品中的应用

NT成功用于检测真实水样（自来水、黑虎泉、大明湖水）、人血清和肉类的pH。所有样本中，比率值（I672/I715）与pH线性相关（R²>0.99），回收率99.2-101.8%，CV<2.8%，与pH计结果无显著差异。肉类新鲜度检测中，NT能区分正常肉（pH≈5.9-6.3）和腐败肉（pH>6.7）：4°C储存3天肉样pH无变化，而35°C储存1天即腐败（pH升至7.5）。NT还可监测增稠剂引起的粘度变化，荧光强度与果胶/黄原胶浓度线性相关，证明其在复杂基质中的实用性。

本研究开发的近红外比率荧光探针NT成功实现了对pH和粘度的同步、高灵敏度检测。NT基于ICT机制，通过羟基去质子化实现pH响应（线性范围pH 6.2-7.8，pKa=6.95），并通过抑制TICT过程响应粘度变化，具备快速、可逆和抗干扰等优势。在实际应用中，NT准确测量了水样、人血清和肉类的pH，回收率接近100%，且能监测增稠剂引起的粘度变化。细胞实验中，NT展现出低毒性和光稳定性，可监测细胞内pH和粘度变化，为癌症细胞（高粘度、低pH）研究提供工具。NT的创新性在于首次将NIR比率检测与双参数传感结合，避免了传统方法的扩增步骤或复杂操作，在环境监测、食品安全和生物医学诊断中具有广泛应用潜力。未来工作可优化探针靶向性，用于体内实时成像和疾病机制探索。

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.saa.2024.124486