新型便携式生物传感器问世：利用表面展示草甘膦氧化酶的工程菌实现快速可视化检测

背景

草甘膦（glyphosate）作为一种广谱除草剂，自1974年注册为“Roundup®”以来在全球范围内广泛使用。其作用机制是通过抑制植物体内的5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶（EPSPS），阻断芳香族氨基酸的合成，从而导致植物死亡。

尽管草甘膦曾被认为对人与动物毒性较低，但近年研究发现其在环境中残留可能通过土壤吸附和水体迁移对生态系统与非靶标生物造成潜在风险。多项动物实验表明，草甘膦暴露可引起氧化应激、DNA损伤甚至细胞凋亡。国际癌症研究机构（IARC）于2015年将草甘膦归类为“可能对人类致癌”。因此，建立快速、灵敏、低成本的草甘膦检测方法对于环境监测与食品安全具有重要意义。

目前常用的检测方法如离子色谱、气相色谱-质谱联用（GC-MS）和液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）等虽然准确度高，但设备昂贵、前处理复杂、依赖专业操作，难以适用于现场快速筛查。因此，开发便于携带、操作简单、成本低廉的检测技术成为当前研究的热点。

研究方法与技术路线

1. 酶定向进化与筛选

本研究在前期获得的草甘膦氧化酶B5R18基础上，进一步通过易错PCR构建突变库，结合高通量酶偶联比色法筛选出催化活性和热稳定性均显著提升的变体B6R11（突变位点：A47V/T198T/R250G）。该变体在65°C下仍保留40%以上活性，而B5R18在同等条件下几乎完全失活。

2. 表面展示系统构建

利用来自苏云金芽孢杆菌CTC株的S层蛋白同源模体（SLH），将B6R11与绿色荧光蛋白（GFP）融合表达于晶体阴性苏云金芽孢杆菌BMB171表面。通过荧光显微镜、3C蛋白酶切割、免疫荧光和Western blot等多种手段验证了B6R11成功定位于细胞表面。

3. 全细胞催化剂性能评估

表面展示的B6R11在催化草甘膦时生成H₂O₂，进而通过辣根过氧化物酶（HRP）氧化底物邻联茴香胺（o-dianisidine）产生在450 nm处有特征吸收的橙红色产物。系统优化反应时间、温度与pH后，确定最佳反应条件为65°C、pH 8.0、反应30分钟。

图 1. 用于检测草甘膦的生物传感器示意图。蓝色细菌：BMB171。黄色细菌：表面展示的 B6R11

图2. 细菌表面展示外源蛋白的验证。(A–C) 携带 pHT304-GFP (A)、pHT304-csaAB-slh-GFP (B) 和 pHT304-csaAB-slh-B6R11-GFP (C) 的 BMB171 细胞的荧光显微图。(D) 表面展示蛋白的 3C 蛋白酶切割示意图。(E) 缓冲液孵育后回收的 GFP (管 b) 和 B6R11 (管 d) 表面展示细胞的上清液。控制株 (管 a)、GFP (管 c) 以及 B6R11 (管 e) 表面展示细胞在含 3C 蛋白酶缓冲液孵育后的回收上清液；管 f 显示来自管 e 溶液的草甘膦氧化酶活性。(F) 无 3C 蛋白酶时控制株上清液 (泳道 1) 及管 a–e 上清液 (泳道 2–6) 的 SDS-PAGE 分析。(G) 来自管 a (泳道 1)、c (泳道 2) 和 e (泳道 3) 上清液的 Western 印迹验证

研究结果与性能分析

1. 催化效率与稳定性

表面展示的B6R11其表观Km值为0.307 mM，略高于游离酶（0.0925 mM），但催化常数Kcat提升至117.82 min⁻¹，催化效率（Kcat/Km）达383.8 mM⁻¹·min⁻¹，较游离酶提高约2倍。此外，全细胞催化剂在75°C下处理1小时仍保留60%活性，表现出优异的耐热性。

2. 长期储存稳定性

在28°C下储存35天后，表面展示的B6R11仍保留95%以上活性，而游离酶活性仅剩20%。这表明细胞表面展示显著增强了酶的稳定性，有利于实际应用中的保存与运输。

3. 检测性能与选择性

在5–400μM的草甘�浓度范围内，吸光度与浓度呈良好线性关系，检测限为0.82 μM（0.139 mg/L），低于WHO规定的饮用水中草甘膦限值（0.90 mg/L）。对甘氨酸、AMPA、草铵膦和磷酸根等干扰物的测试显示，该系统对草甘膦具有高度选择性。

4. 实际样品回收率

在自来水、湖水及土壤等真实样本中添加已知浓度草甘膦进行回收实验，回收率介于97.5%–109.1%之间，相对标准偏差小于3.7%，表明该方法具有良好的准确性与实用性。

便携式检测装置的开发与应用

研究团队利用表面展示B6R11的工程菌作为核心识别元件，开发出一套便携式检测装置。该装置包括：

滤柱与0.22 μm尼龙PTFE滤膜：用于截留反应后附着橙红色产物的菌体；

标准比色卡：基于不同浓度草甘膦反应后滤膜颜色的RGB值构建，支持视觉比对与半定量分析。

在使用时，用户只需将待测样品与全细胞催化剂、HRP和底物混合反应后，通过滤柱压滤，即可根据滤膜颜色与比色卡对比判断草甘膦含量。该装置在0.05–1 mM范围内具有良好的线性关系，检测限为0.013 mM，适用于现场快速筛查。

图3. (A) 过滤膜的FESEM图像。 (B) 过滤稀释反应混合物后的过滤膜FESEM图像。 (C) 生物传感器组装及应用示意图。 (D) 感测装置的草甘膦检测比色分析。用于过滤不同浓度草甘膦(0.05–5 mM)反应混合物的过滤膜照片及RGB值。 (E) 颜色对照卡。 (F) 过滤膜的(R - G)/(R - G - B)值与0.05–1 mM草甘膦反应混合物之间的关系。误差线表示标准差(SD, n = 3), 变异系数(CV) < 2.08 %

结论与展望

本研究通过酶定向进化与细菌表面展示技术，成功构建了一种高稳定性、高活性的全细胞催化剂，并在此基础上开发出便携式草甘膦生物传感器。该传感器具备以下优势：

操作简便：无需复杂设备与专业培训；

成本低廉：菌体可通过培养大量获取，避免酶纯化步骤；

稳定性强：表面展示酶在常温下长期保持活性；

可视化输出：支持现场定性及半定量分析。

尽管当前系统在灵敏度方面仍有一定提升空间，研究团队表示未来将结合电化学与化学发光方法，进一步开发新一代便携式草甘膦检测传感器，以拓展其在实际环境与食品样品中的应用前景。

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.bios.2025.117974