革新细菌检测：新型侧向层析试纸可同时检测总菌与病原菌

研究背景：总菌检测的困境与侧流分析的局限

在饮用水、工业用水、食品及药品生产乃至室内空气质量管理中，微生物安全评估至关重要。这不仅需要检测特定的致病菌，总细菌数量也是一个关键指标，能有效预警环境卫生风险。不同场景的安全阈值差异巨大，从废水中的10⁵ CFU/mL到游泳池水的10² CFU/mL不等。

目前，平板培养计数法是总菌计数的“金标准”，但其耗时漫长（至少24小时），需要专业实验室，且无法培养样品中绝大多数自然存在的细菌。为克服这些缺点，ATP生物发光法、流式细胞术、PCR等无需培养的方法应运而生，但它们通常依赖大型、昂贵的设备及专业操作人员，难以普及至现场快速检测。

侧流分析作为一种便携、快速、低成本的即时检测平台，已在医学诊断和致病菌检测中广泛应用。然而，传统的LFA依赖于抗原-抗体的特异性结合，其检测线抗体仅针对某一种或一类细菌。由于缺乏一种能够结合所有细菌的“通用抗体”，传统LFA无法用于总菌检测。此外，一旦出现新的病原体爆发，就必须为这种新细菌从头制备全新的试纸条，过程繁琐且时效性差。。

技术突破：通用型生物素化侧流分析的原理

针对上述挑战，研究团队巧妙利用了生物素-链霉亲和素这一自然界中结合力最强、最稳定的非共价作用系统之一，设计了一种通用型检测策略。

核心技术路线如下：

1.细菌的通用标记：使用sulfo-NHS-biotin试剂，与细菌表面脂蛋白的氨基发生非特异性反应，从而在所有类型的细菌表面标记上生物素分子。

2.报告系统的通用设计：将链霉亲和素修饰到金纳米颗粒表面，形成Str-AuNP报告探针。同时在试纸条的检测线上固定链霉亲和素。

3.检测与信号生成：当表面带有生物素的细菌样品在试纸条上流动时，细菌会被检测线上的链霉亲和素捕获。随后，Str-AuNP报告探针流过，其表面的链霉亲和素会与细菌上标记的生物素结合，从而将金纳米颗粒固定在检测线位置，累积形成肉眼可见的红色条带。条带颜色深浅与细菌浓度相关，可实现半定量。

这一设计的精妙之处在于，检测的通用性来自于前端的生物素化标记，而非后端的抗体识别。只要细菌能被生物素化，就能被同一个试纸条检测，从而实现了总菌检测。

图1. 基于生物素化的侧流检测法用于总细菌检测的示意图。

关键实验与优化：确保高效与可靠

1. 细菌生物素化条件优化

研究以大肠杆菌DH5α为模型，优化了标记条件。流式细胞术和荧光显微镜结果显示：

生物素浓度：在0.1至10 mg/mL范围内，标记效率随浓度增加而提高。为确保所有细菌被充分标记，选择10 mg/mL的sulfo-NHS-biotin用于后续实验。

孵育时间：15分钟即可达到饱和标记。实验采用20分钟孵育以保证稳定性。

广谱性验证：对乳酸菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、金黄色葡萄球菌等多种菌株进行测试，均成功实现生物素化，证明了该方法的普适性。

2. 链霉亲和素-金纳米颗粒报告系统的制备与优化

为确保Str-AuNP探针的稳定性与活性，优化了制备条件：

最佳pH：pH 7.0时，金纳米颗粒与链霉亲和素的结合最稳定。

最佳链霉亲和素浓度：60 μg/mL时，能形成稳定的、耐盐的胶体金复合物。

表征确认：紫外-可见光谱显示，成功偶联后的Str-AuNP在530 nm（金纳米颗粒等离子共振峰）和280 nm（链霉亲和素蛋白特征峰）处均出现吸收峰。

3. 检测灵敏度与性能

在优化条件下，该试纸条对多种细菌的检测限在 1×10⁴ 至 5×10⁴ CFU/mL 之间。通过进一步优化检测线上链霉亲和素的浓度（1 mg/mL）和结合垫上Str-AuNP的负载量，可将部分菌株（如大肠杆菌DH5α）的检测限提升至 2×10³ CFU/mL。

利用ImageJ软件对检测条带进行灰度分析，该试纸条在 1×10⁴ 至 5×10⁵ CFU/mL 浓度范围内展现出良好的半定量能力。

图2. 细菌的生物素化及金纳米颗粒(AuNP)与链霉亲和素的偶联。(a1-a5) 生物素化细菌的流式细胞仪(FCM)直方图，这些细菌使用Str-AF647-R-PE染色。细菌使用不同浓度的sulfo–NHS–biotin进行生物素化，浓度范围为0.1至20 mg/mL。(b) sulfo–NHS–biotin浓度对细菌生物素化的影响。(c) 孵育时间对细菌生物素化的影响。(d–e) 细菌的代表性荧光图像，(e) 为生物素化细菌，(c) 为未生物素化细菌。进行生物素化时，使用10 mg/mL的sulfo–NHS–biotin与细菌孵育20分钟。(j–k) 链霉亲和素与AuNP偶联的pH值(j)及链霉亲和素浓度(k)优化。与不足量链霉亲和素分子偶联的AuNP会在10% NaCl存在下沉淀，从而显示颜色减弱。(l) 链霉亲和素偶联AuNP的分光光度分析。(b)、(c)及(f–k)进行了三次独立实验，数据以均值 ± 标准差表示 (n = 3)。

实际应用验证：总菌与致病菌检测的双重演示

1. 真实水样中的总菌检测

研究团队对自来水、池塘水和空调废水等9份真实水样进行了测试。

结果：所有自来水及一份池塘水样品为阴性；其余池塘水及所有废水样品为阳性。

方法学对比：将LFA检测结果与传统的平板计数法和流式细胞术进行对比。LFA和FCM的检测结果基本一致，且均显著高于平板计数结果。这印证了自然界中存在大量“可存活但不可培养”的细菌，而基于生物素化的LFA和FCM能够更真实地反映样品中的总菌负荷。

2. 特异性致病菌检测（无需更换试纸条）

为展示该平台的灵活性，研究者将其应用于致病菌大肠杆菌O157:H7的特异性检测。

策略切换：不再使用非特异性生物素化，而是改用生物素偶联的抗大肠杆菌O157:H7特异性抗体对目标菌进行标记。这样，只有目标菌会被生物素化。

检测过程：使用同一个为总菌检测制备的试纸条（检测线为链霉亲和素），对上述特异性标记的样本进行检测。

性能：该试纸条对大肠杆菌O157:H7的检测限达 2×10³ CFU/mL，并在 1×10³ 至 5×10⁴ CFU/mL 范围内有良好线性。交叉实验表明，试纸条仅对大肠杆菌O157:H7产生强信号，对其他8种非目标菌株无响应，显示出优异的选择性。

这一部分的关键突破在于：通过简单改变样本前处理中的标记策略（从非特异性生物素化切换到抗体介导的特异性生物素化），即可利用同一套试纸条和检测平台，在“总菌筛查”和“致病菌鉴定”两种模式间自由切换，无需重新制备试纸条。

图3.所开发的 LFA 试纸条测试。(a1-e1) 对菌株 L. casei、铜绿假单胞菌 (P. aeruginosa)、大肠埃希菌 DH5a、鲍曼不动杆菌 (A. baumannii) 和金黄色葡萄球菌 (S. aureus) 的测试结果照片，浓度范围为 0.5 × 10 到 50 × 10⁴ cfu/mL。T，测试线；C，对照线。(a2-e2) 上述样品测试线对细菌浓度的平均条带强度响应。(a2-e2) 中进行三次独立实验，数据以平均值 ± 标准差表示 (n = 3)。

图4. 基于生物素化的LFA用于病原菌检测。 (a) LFA示意图。 (b) 通过生物素结合的抗大肠杆菌O157:H7抗体对大肠杆菌O157:H7进行特异性生物素化。生物素化细菌用Str-AF647-R-PE染色，并通过流式细胞术(FCM)进行红色荧光分析。 (c) 大肠杆菌O157:H7测试结果的照片，浓度范围从0.5 × 10^36到50 × 10^x的大肠杆菌O157:H7浓度。(e–f) 所开发LFA对参考细菌的选择性，参考细菌浓度为1 × 10^33 cfu/mL。(d) 测试线对比参考细菌的大肠杆菌O157:H7的cfu/mL响应平均带强度。cfu/mL的浓度。对于(b)、(d)和(f)，进行了三次独立分析，数据以平均值 ± 标准差表示 (n = 3)。

技术优势与意义

本研究开发的基于生物素化的侧流分析技术，具有以下突出优势：

1.首创总菌快检：突破了传统LFA缺乏通用识别元件的限制，首次实现了对环境中总细菌数量的快速、现场检测。

2.一板双用，灵活高效：同一套硬件平台和试纸条，可通过样本标记方式的改变，无缝兼顾广谱性总菌筛查和高特异性致病菌检测，极大提升了应对不同检测需求的灵活性。

3.成本低廉，操作简便：避免了为每种细菌制备特异性抗体-金标复合物和包被抗体的复杂工序，试纸条制备流程简化，更适用于资源有限的环境。

4.结果可靠：与流式细胞术等先进方法结果吻合，且能检出不可培养的活菌，比传统平板计数更能反映真实微生物风险。

结论与展望

该研究成功地将生物素-链霉亲和素系统创新性地应用于侧流分析领域，构建了一个功能可切换的通用型微生物检测平台。它不仅为水环境、食品工业等领域的日常卫生监控和突发微生物污染事件应急检测提供了强有力的工具，也为开发其他基于通用标记原理的快速检测技术提供了新思路。这种“节俭科学”的理念，有助于推动低成本、高性能的检测技术在全球环境与健康监测中的普及应用。

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.aca.2025.343607