给空气做核酸体检：一步法CN-TAR快速识别MRSA与VRE

细菌耐药性已成为21世纪最严峻的全球公共卫生挑战之一，其背后既有新型抗生素研发受限，也有传染病传播加速等因素叠加，导致耐药相关死亡负担持续上升。尤其值得关注的是，MRSA与VRE等重要耐药病原不仅可引发肺炎等严重感染，其在空气中的传播与扩散也已被报道，提示环境与院感场景中存在被忽视的暴露风险。在此背景下，若不能实现对潜在健康威胁的快速识别与及时响应，就难以及早采取隔离、消杀或风险预警等措施，因此亟需可用于现场的快速检测技术，用于空气中耐药基因的快速检测与风险预警，并为感染控制措施提供决策支持。近年来，基于核酸的检测策略因具备天然特异性与扩增能力，在稳定性、灵敏度与准确性方面具有优势，被认为适合现场或床旁应用；然而，常见等温扩增方案如RT-LAMP在实际落地中仍面临引物体系复杂、最佳温度范围窄、对反应条件要求严格等问题，且不少方法依赖精确控温、操作流程繁琐或需要多种酶协同，从而限制了现场部署。基于此，本研究提出Cas9 nickase触发扩增反应（CN-TAR）用于空气中耐药菌的现场检测策略（图1）：通过静电空气采样富集细菌并提取核酸后，将样本加入单管一步反应体系；Cas9 nickase在sgRNA引导下特异识别靶基因并形成局部单链区，促使环状DNA结合并启动滚环扩增（RCA）实现等温信号放大；扩增产物形成G-四链体并与Thioflavin T结合产生荧光信号，最终在便携式等温设备上实现实时读出与定量分析，从而支持对MRSA（mecA）与VRE（vanA）等耐药基因的快速监测。

针对这两种目标基因，在培养菌提取的gDNA定量检测中，CN-TAR检出限分别达到MRSA 1.40 copies/μL与VRE 1.13 copies/μL（R²>0.9），如图2所示，证明CN-TAR具备面向实际样本的高灵敏度与可量化输出。在实验舱模拟的空气采样场景中，研究采用125 L密闭舱构建细菌气溶胶，使用高流量静电采样器以250 L/min进行采集，并在混合菌气溶胶条件下开展检测验证；结果显示CN-TAR能够在含MRSA样本中特异检出mecA、在含VRE样本中特异检出vanA，并在混合菌背景下保持清晰的实时与终点荧光差异，且与常规RT-PCR结论可比（图3），从而验证了该平台用于空气中耐药菌现场监测与预警的应用可行性。

综上，本研究面向空气传播场景下耐药菌快速监测与预警的需求，提出并验证了CN-TAR单管一步检测体系，将Cas9 nickase的高特异靶向识别与RCA等温扩增及荧光读出机制整合到可在便携式平台运行的流程中，为空气样本中MRSA（mecA）与VRE（vanA）的现场筛查提供了更简化且可部署的技术路线；其主要创新在于以“靶向触发-等温放大-即时读数”的一体化设计降低操作门槛，同时保持对耐药基因的灵敏检测能力。与此同时，该体系目前仍以少数耐药基因为靶标，检测通量与覆盖范围有待扩展；此外，现阶段流程仍依赖核酸提取并需要一定反应时间，且便携平台条件下反应设定为30°C、2 h，进一步提速仍有空间。未来研究可围绕多靶标并行与内参质控体系构建、反应动力学加速以缩短检测时长、采样-裂解-扩增-读出的卡匣化/芯片化集成，以及开展更大规模的空气监测应用验证与标准化参数体系建立，从而推动CN-TAR从方法学创新走向可推广的空气耐药监测技术平台。

图1  Cas9 nickase触发扩增反应（CN-TAR）用于空气中耐药菌检测的总体概览。(a) 采用静电空气采样器采集空气中的耐药菌样本，并使用CN-TAR体系进行靶基因检测的示意流程。

(b) CN-TAR检测体系的整体工作流程示意。

图2  基于CRISPR的CN-TAR对细菌提取基因组DNA（gDNA）的检测灵敏度。MRSA与VRE的gDNA在不同浓度下的实时荧光曲线(a,b)、对应的终点荧光信号(c,d)，以及用于定量分析的标准曲线(e,f)；所有实验均为三次重复。

图3  CN-TAR在空气采样捕获样本中的性能评估。(a) CN-TAR用于静电空气采样器捕获细菌样本的检测流程；采样舱内喷雾菌种包括MRSA、MSSA、VRE、VSE，并按不同组合条件分组。(b,d) CN-TAR检测mecA的实时荧光与终点荧光结果（MRSA相关组）。(c,e) CN-TAR检测vanA的实时荧光与终点荧光结果（VRE相关组）。

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.jhazmat.2025.138850