不用抗体也能精准抓菌：基于LecB–甘露糖识别的铜绿假单胞菌电化学传感

铜绿假单胞菌是一种革兰阴性机会致病菌，是医院获得性感染的重要病原，可在免疫功能低下人群中引发医院获得性肺炎、呼吸机相关肺炎、泌尿系感染及烧伤创面感染等严重疾病。同时，该菌广泛存在于水体、医院环境与食品等自然和人工生态位，可经空气、水和土壤传播，具有持续的公共卫生风险。因此，建立快速、灵敏且便于现场应用的检测方法，对早期诊断、及时用药与污染源追踪具有关键意义。传统平板计数虽为金标准，但操作周期长且特异性不足，难以满足快速筛查需求；PCR和质谱等替代技术往往依赖昂贵仪器和专业人员，限制了在基层和资源受限场景的推广。电化学生物传感器因其成本低、响应快、易微型化而备受关注，其中阻抗型检测可通过界面电荷转移阻力变化实现无标记定量。然而，要获得高性能传感器，既需要具备高选择性的生物识别元件，也需要合适的固定化载体以保障信号传导效率。

凝集素LecB可特异识别铜绿假单胞菌表面Psl多糖中的α-D-甘露糖残基，并参与生物膜聚集与稳定，为特异捕获提供天然靶向基础；纳米多孔金具有海绵状三维多孔结构、丰富结合位点及优良导电和电催化特性，适合作为识别元件的固定化界面。基于上述优势组合，本研究构建了一种以LecB/纳米多孔金（NPG）为核心的阻抗型电化学生物传感策略：首先将NPG修饰于玻碳电极表面，以其三维连通孔道提供高比表面积与丰富结合位点；随后将电极浸泡于LecB溶液中，使LecB在NPG上高密度固定，形成LecB/NPG/GCE识别界面。检测时，待测样品中的铜绿假单胞菌可通过其表面Psl多糖的α-D-甘露糖结构与LecB发生特异结合并被捕获在电极表面，细菌覆盖层相当于在导电界面上引入一层“阻隔屏障”，从而显著抑制电极与溶液中氧化还原探针之间的电子转移，使电荷转移电阻（Rct）增大。通过电化学阻抗谱对Rct变化进行无标记读出，即可实现对铜绿假单胞菌的快速定量检测（图1）。

图1  基于LecB固定化纳米多孔金电极的铜绿假单胞菌阻抗检测原理示意图

研究的核心包括2部分：

（1）界面构建与逐步表征：验证“传感界面确实按设计搭建成功”。

该部分从材料与电化学两条证据链同时展开。其一，形貌与元素证据表明纳米多孔金具有开放的三维孔结构，利于蛋白固定；在加载LecB后表面形貌发生覆盖性变化，EDS出现C、N、O等蛋白特征元素，配合荧光标记信号，证明LecB已稳定固定于NPG表面。其二，电化学证据显示NPG修饰后循环伏安峰电流增强、阻抗半圆减小，说明导电性与有效比表面积提升；进一步固定LecB后电流下降、Rct回升（图2），表明蛋白层形成了可控的界面阻挡，为后续以Rct变化作为检测信号奠定基础。

图2  LecB/NPG/GCE生物传感器的形貌与电化学表征

（2）检测性能与机理验证：证明信号来自特异捕获且可用于可靠定量

在此部分，作者首先通过对照实验验证了方法的可行性：当存在高浓度（10⁶–10⁸ CFU mL⁻¹）铜绿假单胞菌时，无LecB修饰的NPG电极出现明显阻抗上升，提示存在非特异吸附；而LecB/NPG/GCE传感器对低浓度目标菌即可产生显著响应，证明LecB的关键识别作用。在此基础上，作者将传感器与不同浓度细菌孵育30 min后进行EIS检测，得到Rct随浓度从10到10⁶ CFU mL⁻¹逐步升高，并建立线性定量关系R²=0.994，同时给出检测限10 CFU mL⁻¹。进一步地，作者展示了方法的抗干扰能力，将目标菌与非目标菌（S. aureus、L. monocytogenes、E. sakazakii、P. putida B6-2、P. putida KT2440）在相同浓度（10³ CFU mL⁻¹）下按1:1混合时，带来的Rct相对变化分别仅2.33%、3.56%、5.95%、0.21%、1.15%，均小于6%，表明抗干扰性能良好。在重复性方面，5个独立电极检测10² CFU mL⁻¹时Rct的RSD <6%；储存稳定性方面，放置1周和2周后仍保留原始响应的99.21%与94.96%（图3）。进一步在自来水、牛奶与人血清中加标10²/10³ CFU mL⁻¹，回收率93.05%–119.63%且RSD <7.85%（表1），验证了复杂基质中的定量可用性。

综上，本研究以凝集素LecB对铜绿假单胞菌表面Psl多糖中α-D-甘露糖残基的特异识别为核心，结合纳米多孔金的高比表面积与优良导电界面，构建了无标记阻抗型电化学生物传感平台，实现了对铜绿假单胞菌的快速灵敏检测思路，为临床早期筛查、食品与水环境监测提供了可推广的技术路线。其创新性在于将“凝集素-糖链”这一天然分子识别机制引入细菌阻抗传感，并通过多孔金界面实现识别元件高密度固定与信号放大，从而以电荷转移电阻变化完成定量读出。该方法在复杂样本中的主要局限是：当非目标菌或基质杂质含量很高时，它们也可能黏附在NPG电极上并增大Rct，从而产生假阳性或降低检测特异性。这一问题在混菌污染、环境样本或临床分泌物等高菌量场景中尤需关注。未来工作可围绕电极表面抗污封闭与选择性过滤策略、降低非特异黏附、优化检测阈值与判别模型，并进一步结合便携化读出与多菌种真实样本的大规模验证，推动该平台向现场快速检测与标准化应用转化。

图3  基于电化学阻抗谱的LecB/NPG/GCE生物传感器对铜绿假单胞菌的检测性能评估。(A) 可行性验证：比较加入与未加入铜绿假单胞菌时的阻抗响应，证明传感器可产生可分辨的信号变化。(B) 非特异吸附对照：仅使用NPG/GCE电极，在10²–10⁸ CFU·mL⁻¹浓度范围内测试，用于评估细菌在无LecB情况下对电极的非特异吸附影响。(C) 检测响应曲线：使用LecB/NPG/GCE传感器，在10–10⁶ CFU·mL⁻¹范围内获得阻抗谱响应，展示浓度依赖性变化。(D) 定量关系：电荷转移电阻Rct与铜绿假单胞菌浓度对数之间的线性拟合，用于建立定量校准曲线。(E) 特异性：加入非靶菌干扰时的响应对比，用于证明对铜绿假单胞菌的选择性识别。(F) 重复性：多支电极或重复测定的响应一致性评估，用于表征方法的可重复性。

表1  自来水、牛奶与人血清加标铜绿假单胞菌的回收率验证结果

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.bios.2025.117788