从单价到多价：RCA构建多价适配体功能化磁珠提升捕获效率与检测灵敏度

铜绿假单胞菌作为一种重要条件致病菌，除临床感染外，其在食品链中的潜在污染与传播风险也逐渐受到关注，但在常规食品微生物监测中仍可能被低估。在复杂食品基质中，目标菌往往处于低丰度状态，同时存在大量蛋白、脂肪及杂菌背景，容易造成检测信号被稀释或干扰，因此亟需一种既具备高灵敏度又能抗基质干扰的快速检测策略，以满足食品安全现场筛查和风险预警的实际需求。相较于抗体等识别元件，适配体具有可合成、易修饰、稳定性较好等优势，但单价适配体在固相界面上的有效结合位点有限，容易限制捕获效率与低浓度检测能力。为突破这一瓶颈，本研究引入滚环扩增在磁珠表面原位构建多价适配体网络，通过多位点协同结合显著增强对目标菌的捕获富集能力，并结合磁分离实现快速净化，将读出转换为上清液荧光的“信号开启”响应，从而在降低背景的同时提高定量可靠性。

研究设计思路如图1所示，本研究以“捕获富集放大+低背景信号读出”为主线：首先通过padlock探针环化构建环状模板，并在链霉亲和素-生物素固定引物的磁珠表面触发滚环扩增（RCA），原位生成含重复单元的长链DNA，从而构建高密度多价适配体网络以显著增加有效结合位点并增强对铜绿假单胞菌的捕获效率。随后引入FAM标记互补链（FAM-cDNA）与多价适配体杂交形成可置换的荧光探针复合体；当目标菌存在时，其与适配体特异结合并竞争性置换FAM-cDNA，使荧光探针释放至溶液相。最终通过磁分离去除磁珠-细菌复合物，仅检测上清液荧光实现signal-on定量读出，在提升富集能力的同时降低基质背景干扰。

图1  滚环扩增生成的多价适配体功能化磁珠用于铜绿假单胞菌检测的示意图。

相较于单价适配体（MB-Apt），多价适配体磁珠（MB-mApt）通过RCA在磁珠表面引入高密度重复结合位点，形成多点协同结合，从而显著提升对铜绿假单胞菌的捕获富集能力。如图2所示，在初始菌浓度为10⁴ CFU/mL的条件下，MB-mApt的捕获效率超过81%，明显高于MB-Apt（约39%），表明“结合位点多价化”可有效克服固相界面有效位点有限所导致的捕获瓶颈。同时，共聚焦成像进一步显示MB-mApt周围细菌荧光信号更强，且未修饰磁珠几乎无明显吸附，提示该增益主要来源于多价识别而非非特异吸附。

图2  MB-mApt对铜绿假单胞菌的捕获性能验证。(a) 对比三类细菌数量：原始菌液、被磁珠复合物捕获的菌量、以及上清液中残留菌量，用于表征捕获造成的菌量分配变化。(b) 比较MB-Apt与MB-mApt的捕获效率（n=3），用于定量评估多价化带来的捕获增益。(c) SYTO染色铜绿假单胞菌被MB-Apt与MB-mApt捕获后的共聚焦显微成像（CLSM），以形象证据辅助验证捕获效果差异。

所建立的基于多价适配体磁珠的荧光传感体系在定量性能与选择性方面表现出良好分析能力。随着铜绿假单胞菌浓度升高，上清液荧光发射强度呈浓度依赖性增强，体现了目标诱导置换释放荧光探针的signal-on响应特征。进一步分析表明，荧光强度与细菌浓度对数在10¹–10⁷ CFU/mL范围内具有良好线性关系（R² = 0.97503），并依据LOD = 3N/S（N为空白样品荧光强度标准差，S为校准曲线斜率）计算得到检出限为2 CFU/mL，说明该方法具备超灵敏定量检测潜力。与此同时，在选择性评估中，目标菌与8种非目标菌均以10⁴ CFU/mL进行对照，结果显示非目标菌引起的荧光响应显著低于目标菌（P < 0.05），表明该体系具有较低交叉反应和良好选择性（图3）。进一步，在真实食品基质中对方法的可用性进行了验证。表1展示了牛奶样品的加标回收结果：在2.37×10²、2.37×10⁴与2.37×10⁶ CFU/mL三个加标水平下，检测值分别为2.12×10²、2.16×10⁴与2.52×10⁶CFU/mL，对应回收率为89.33%–106.35%，相对标准偏差（RSD）为2.62%–8.83%（n=3）。上述结果表明，该多价适配体磁珠荧光传感体系在牛奶这类复杂基质中仍能保持较好的定量准确性与重复性，提示其具备一定抗基质干扰能力和实际应用潜力，可为食品样品中铜绿假单胞菌的快速筛查提供方法学支撑。

图3  基于多价适配体磁珠的荧光传感体系对铜绿假单胞菌的定量性能与选择性评估。(a) 不同浓度铜绿假单胞菌引起的荧光发射光谱变化，用于展示浓度依赖的signal-on响应。(b) 荧光强度与菌浓度（log10）之间的线性拟合曲线，并给出检出限（LOD）计算方式，用于评价定量能力与灵敏度。(c) 目标菌与8种非目标菌的荧光发射光谱对比，用于评估交叉反应与选择性。(d) 目标菌与8种非目标菌的荧光强度统计比较（显著性检验，P<0.05），用于量化选择性差异。

表1  牛奶样品中不同浓度铜绿假单胞菌加标回收结果。

综上，本研究创新性地在磁珠表面原位滚环扩增构建多价适配体网络，将“识别位点多价化”作为捕获富集放大器，并耦合目标诱导置换的上清荧光signal-on读出，实现铜绿假单胞菌的低背景超灵敏定量检测，体现了"由扩增靶标转向扩增识别位点"的方法学价值。该方法通过将适配体序列嵌入环状模板，利用RCA在磁珠表面原位合成含重复适配体单元的长链DNA，实现识别位点的高密度多拷贝构建。其局限在于多价构建依赖酶促与离子条件，现场可重复性与长期稳定性仍需强化，且对菌株差异、混合菌背景下的交叉反应与假阳性风险仍需更大规模样本验证。

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.snr.2026.100452