革命性生物传感器：双CRISPR/Cas驱动，智能手机辅助，45分钟快速检测总活菌

近食源性病原体污染每年影响数亿人，严重威胁全球公共卫生。及时筛查传染性细菌对保护人类健康至关重要。目前，金标准的培养方法能提供详细细菌信息，但耗时长、操作繁琐，无法满足现场检测需求。其他方法如ELISA、侧流层析试纸、qPCR和LAMP虽缩短了检测时间，但不能区分活细菌，而活细菌才是导致感染的真实原因。现有活菌检测方法如基于ATP或H2S的代謝物法无法区分特定菌种，而整合核酸扩增技术与丙啶单氮唑的方法虽具高灵敏度，但涉及额外处理时间，且复杂基质可能导致假阳性。与基因组DNA在死菌中仍稳定不同，大多数RNA在细菌死亡后迅速降解。因此，通过特异性RNA水平可量化活菌。近年来，基于细菌RNA的策略如RT-PCR和RT-LAMP被证明有效，但需耗时纯化步骤以避免同源基因组DNA干扰，且非特异性扩增和气溶胶污染风险不可避免。CRISPR/Cas系统作为细菌和古菌适应性免疫系统的关键单元，能特异性识别靶核酸并在crRNA辅助下展示切割活性。通过将CRISPR/Cas系统与电化学、SERS、侧流层析试纸和微流控结合，已构建出各种免扩增、灵敏的生物传感器。靶DNA激活的CRISPR/Cas12a系统可随机片段化ssDNA报告分子，而靶RNA激活的CRISPR/Cas13a系统可切割ssRNA报告分子。现有证据表明，这两种CRISPR/Cas系统可在同一管内独立工作。基于此，本研究设想开发一种新型生物传感器，通过CRISPR/Cas12a和Cas13a分别特异性识别细菌DNA和RNA。

研究成果

1. 双CRISPR/Cas系统可行性验证

研究首先验证了双CRISPR/Cas驱动荧光检测法同时检测总细菌和活细菌的可行性(如Figure 1所示)。针对金黄色葡萄球菌（S. aureus）的femA基因设计CRISPR/Cas12a系统，并针对其mRNA设计CRISPR/Cas13a系统。实验显示，CRISPR/Cas12a系统仅在靶DNA存在时产生荧光信号，而CRISPR/Cas13a系统仅在靶RNA存在时触发信号。将两个系统集成到单管中后，靶DNA和靶RNA分别诱导特征荧光信号，且共存时互不干扰。提取细菌总核酸后检测表明，活S. aureus激活两个系统，而死S. aureus仅激活CRISPR/Cas12a，证实了DNA稳定而RNA降解的特性，验证了双CRISPR/Cas系统同时检测的可行性。

Figure 1  (A) 双CRISPR/Cas系统同步检测金黄色葡萄球菌总量与活菌示意图。(B) 不同T-DNA与T-RNA组合的荧光光谱响应。(C) 对应(B)图中520纳米和570纳米处的荧光强度。(D) 空白对照、死菌与活菌的荧光光谱响应。(E) 对应(D)图中520纳米和570纳米处的荧光强度。误差线表示平均值±标准差（n=3）。采用t检验进行数据分析：∗表示p < 0.05；∗∗表示p < 0.01；∗∗∗表示p < 0.001；∗∗∗∗表示p < 0.0001。

2. 荧光检测性能评估

通过梯度稀释S. aureus评估双CRISPR/Cas驱动荧光检测的灵敏度(如Figure 2所示)。荧光信号在520 nm和570 nm处随活菌浓度降低而衰减，总S. aureus和活S. aureus的校准曲线在10-10⁷ CFU/mL范围内呈线性，检测限为10³ CFU/mL。死S. aureus仅触发520 nm信号，线性关系良好。特异性测试显示，仅S. aureus产生显著信号，其他细菌与空白对照无区别，表明高特异性。但与培养法和RT-qPCR相比，灵敏度较低，需进一步信号增强。

Figure 2  (A) 不同浓度下活金黄色葡萄球菌的荧光光谱响应。(B) 对应(A)图在520纳米和570纳米的荧光强度。(C) 荧光强度（520纳米和570纳米）随活金黄色葡萄球菌浓度的变化曲线。(D) 不同浓度下死金黄色葡萄球菌的荧光光谱响应。(E) 对应(D)图在520纳米和570纳米的荧光强度。(F) 荧光强度（520纳米）随死金黄色葡萄球菌浓度的变化曲线。(G) 采用平板培养法检测金黄色葡萄球菌。(H) 不同细菌的荧光光谱响应。(I) 对应(H)图在520纳米和570纳米的荧光强度。(J) 实时荧光定量PCR检测金黄色葡萄球菌的实时扩增曲线。(K) 实时荧光定量PCR检测金黄色葡萄球菌的标准曲线。误差线表示平均值±标准差（n=3）。数据采用t检验分析：ns表示无显著性差异；∗表示p < 0.05；∗∗表示p < 0.01；∗∗∗表示p < 0.001；∗∗∗∗表示p < 0.0001。

3. cc-SERS生物传感器的构建与原理验证

为解决灵敏度问题，研究构建了cc-SERS生物传感器。使用银壳金纳米颗粒修饰拉曼分子4-ATP和NBA，形成SERS标签，并与链霉亲和素磁珠共孵育制备MB-探针。无靶细菌时，CRISPR/Cas系统未激活，SERS标签被捕获，无信号；死菌存在时，靶DNA激活CRISPR/Cas12a，切割ssDNA，释放4-ATP标签，产生1079 cm⁻¹信号；活菌存在时，两个系统均激活，释放两个标签，产生1079 cm⁻¹和593 cm⁻¹信号。通过紫外-可见吸收光谱、TEM和动态光散射表征纳米颗粒，验证了传感器构建成功。实验显示，靶DNA和靶RNA分别诱导特征拉曼信号，且互不干扰，死S. aureus仅触发1079 cm⁻¹信号，活S. aureus触发两个信号，与原理一致(如Figure 3所示)。

Figure 3  (A) 通过紫外-可见吸收光谱对Au@Ag探针进行表征。(B-C) 反应溶液照片及对应拉曼响应：(1) Au@Ag-4-ATP探针；(2) Au@Ag-4-ATP探针+MB探针；(3) Au@Ag-4-ATP探针+Cas12a/crRNA+T-DNA+MB探针。(D) 1079 cm⁻¹处拉曼强度对应(C)图数据。(E) 通过DLS分析对Au@Ag探针进行表征。(F-G) 反应溶液照片及对应拉曼响应：(1) Au@Ag-NBA探针；(2) Au@Ag-NBA探针+MB探针；(3) Au@Ag-NBA探针+Cas13a/crRNA+T-RNA+MB探针。(H) 593 cm⁻¹处拉曼强度对应(F)图数据。(I) cc-SERS对金黄色葡萄球菌T-DNA和T-RNA不同组合的拉曼光谱响应。(J) 1079 cm⁻¹和593 cm⁻¹处拉曼强度对应(I)图数据。(K) cc-SERS对空白对照、死菌和活菌的拉曼光谱响应。(L) 1079 cm⁻¹和593 cm⁻¹处拉曼强度对应(K)图数据。误差线表示平均值±标准差（n=3）。采用t检验分析数据：ns表示无显著性差异；****表示p<0.0001。

4. cc-SERS对S. aureus的性能测试

在最优条件下，cc-SERS对S. aureus的检测显示拉曼信号随浓度（10-10⁷ CFU/mL）增加而增强(如Figure 4所示)。总S. aureus和活S. aureus的线性方程分别为Y=3149.44lg(X)+915.96和Y=2723.74lg(X)+2749.77，检测限达10 CFU/mL，与培养法相当，优于许多现有生物传感器。便携拉曼仪与台式仪灵敏度相近，检测时间仅45分钟。特异性测试中，仅S. aureus触发显著信号。稳定性、重现性良好，高浓度死菌对活菌检测干扰小。实际样品（奶粉和牛奶）加标回收率与PBS缓冲液相当，表明传感器鲁棒性强。

Figure 4  (A) cc-SERS对不同浓度活体金黄色葡萄球菌的拉曼光谱响应。(B)对应(A)中1079 cm⁻¹和593 cm⁻¹处的拉曼强度。(C)1079 cm⁻¹和593 cm⁻¹处拉曼强度与金黄色葡萄球菌浓度对数值的关系图。(D)cc-SERS的特异性测试。(E–H)不同浓度金黄色葡萄球菌的拉曼测量稳定性测试。(I–L)不同浓度金黄色葡萄球菌的cc-SERS重现性测试。(M–P)分别检测奶粉和牛奶中掺入的活/死金黄色葡萄球菌。误差线表示平均值±标准差（n=3）。采用t检验进行数据分析：ns表示无显著性差异；∗表示p<0.05；∗∗表示p<0.01；∗∗∗表示p<0.001；∗∗∗∗表示p<0.0001。

本研究成功开发了一种双CRISPR/Cas驱动的免扩增SERS生物传感器（cc-SERS），实现了总细菌和活细菌的同时检测，填补了传统培养法、qPCR及多数现有生物传感器无法区分活菌的空白。该传感器利用DNA在死菌中稳定而RNA快速降解的特性，通过CRISPR/Cas12a和Cas13a系统分别识别靶DNA和靶RNA，结合SERS技术产生特征拉曼信号（1079 cm⁻¹表示总菌，593 cm⁻¹表示活菌）。cc-SERS无需预扩增步骤，操作简便，避免了热循环仪的依赖。通过引入快速预处理方法和智能手机辅助便携拉曼仪，整个检测过程可在现场45分钟内完成，显著提升了现场检测效率。cc-SERS在灵敏度（检测限10 CFU/mL）、特异性、稳定性和重现性方面表现优异，实际样品测试中回收率良好，证明了其鲁棒性。通过简单更换crRNA序列，传感器成功应用于S. aureus和C. sakazakii的检测，展示了良好的通用性。与现有方法相比，cc-SERS在检测时间、便携性和多目标检测能力上具有明显优势，为食源性疾病防控和临床诊断提供了新工具。

原文链接:https://doi.org/10.1016/j.bios.2026.118446