基于CRISPR/Cas12a与MXene纳米复合物的电化学发光生物传感器实现miR31的超灵敏检测

研究背景 

肺癌是全球发病率和死亡率最高的恶性肿瘤，其中非小细胞肺癌（NSCLC）约占85%。由于缺乏有效的早期诊断标志物，多数患者在确诊时已处于晚期，预后极差。miRNA作为一类稳定存在于体液中的小分子RNA，已被广泛认为是癌症早期诊断的理想标志物。miR31在NSCLC组织与血清中显著高表达，并与肿瘤增殖、迁移、侵袭及不良预后密切相关。然而，传统miRNA检测方法（如qRTPCR、测序等）存在操作复杂、耗时昂贵、依赖精密仪器等局限性，难以适用于临床即时检测（POCT）与大规模筛查。

近年来，CRISPR/Cas系统因其高特异性、可编程性及信号放大能力，在分子诊断领域展现出巨大潜力。Cas12a蛋白在识别目标双链DNA后可激活其非特异性切割单链DNA的“反式切割”活性，从而实现信号放大。与此同时，电化学发光技术融合了电化学控制与发光信号输出的优势，具备高灵敏度、低背景噪声与优异时空分辨率等特点。MXene作为新兴二维纳米材料，具有高导电性、大比表面积和丰富表面官能团，可显著增强ECL信号输出与电极界面性能。本研究将这三者有机结合，构建了一种全新的miR31超灵敏检测平台。

研究原理 

该传感器的设计核心在于“信号开启”机制，主要包括以下三个关键模块：

1. 纳米复合电极的构建 

采用PEIRu@Ti₃C₂@AuNPs三元纳米复合材料修饰玻碳电极。其中：

- Ti₃C₂ MXene提供高导电性与大比表面积；

- AuNPs增强电子传递与生物分子固定能力；

- Ru(dcbpy)₃²⁺作为ECL发光体；

- PEI既作为固定骨架，也作为共反应剂参与ECL发光循环。

该结构显著提升了电极的ECL活性与稳定性（图1）。

图1：PEIRu@Ti₃C₂@AuNPs纳米复合材料的TEM与EDS表征

2. 目标触发的级联信号放大 

- miR31识别与等温扩增：miR31与发夹DNA探针结合，启动等温链置换扩增反应，生成大量含有PAM序列的双链DNA。

- CRISPR/Cas12a激活与反式切割：dsDNA激活Cas12a/crRNA复合物，使其获得切割单链DNA的能力。

- 信号转换：电极表面固定的二茂铁标记单链DNA探针被Cas12a切割，二茂铁淬灭基团被移除，Ru基ECL信号恢复。

3. 信号输出与定量 

ECL强度与miR31浓度成正比，通过电化学工作站与光电倍增管系统实现信号采集与定量分析。整个工作原理如图Scheme 1所示：

Scheme 1：传感器工作原理示意图

研究结果 

1. 传感器可行性验证 

通过ECL与电化学阻抗谱（EIS）系统验证了各步骤的有效性（图2）。结果显示，只有在miR31存在时，ECL信号才显著恢复，EIS界面电阻明显下降，证实了目标触发的级联反应成功实现。

图2：传感器可行性验证]

2. 条件优化 

系统优化了Cas12a浓度、反应时间、DNA探针浓度与ISDA扩增时间等关键参数（图3），最终确定最优条件为：Cas12a浓度：100 nM；切割反应时间：40 min；DNA1Fc浓度：1.0 μM；ISDA时间：30 min。

图3：实验参数优化

3. 分析性能 

传感器在最优条件下表现出卓越的分析性能：线性范围：10 aM – 100 pM（跨越7个数量级）；检测限：1.67 aM（基于3σ法计算）；灵敏度：ECL强度与miR31浓度对数呈良好线性关系（R² = 0.9994）。

图4：分析性能曲线

4. 特异性与稳定性 

传感器对miR21、miR17等同源miRNA无明显响应，显示出高序列特异性（图5A）。在4°C下储存7天后，信号保持率超过91%，表现出良好的存储稳定性（图5B）。

图5：特异性与稳定性评估

5. 实际样本验证 

在加标人血清样本中，回收率介于98.12%–104.55%之间，RSD < 5%，表明传感器在复杂基质中仍具备高准确性与重复性。初步临床样本测试也显示，肺癌患者血清中ECL信号显著高于健康对照（图5C），具备良好的临床区分能力。

结语

本研究成功构建了一种基于CRISPR/Cas12a与MXene纳米复合材料的ECL生物传感器，实现了对肺癌相关miR31的超灵敏、高特异性检测。该技术不仅为肺癌早期诊断提供了新工具，也为其他疾病相关核酸标志物的检测提供了可借鉴的技术框架，具有重要的科学价值与临床应用前景。

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.bioelechem.2025.109059