把沙门氏菌和耐药基因一次测出来：RAA-PfAgo试纸条的双靶标快检方案

食源性沙门氏菌传播广、危害大，是食品安全监测的重点，但传统培养与鉴定耗时长，难以满足现场快速筛查需求。同时，替加环素作为重要治疗选择，近年来tet(X)耐药基因出现并可随质粒在不同细菌间扩散，使耐药风险进入食物链。现有PCR依赖仪器且存在低拷贝检出与气溶胶污染等问题，LAMP引物体系复杂且可能假阳性，CRISPR检测又受PAM与crRNA设计稳定性限制。因此，亟需一种灵敏、特异、低设备依赖且能同时检测病原与耐药标志的快检方法。

基于此背景，本研究提出了一个等温扩增+程序化酶切+试纸条判读的串联检测流程（图1）：将针对stn与tet(X)的两套引物与样本基因组DNA混合进行RAA等温扩增，在较短时间内把低拷贝靶序列富集到可检测水平。随后引入PfAgo与Mn²⁺等二价金属离子，并分别加入针对stn与tet(X)的5′端磷酸化gDNA作为序列引导，使PfAgo在识别相应扩增产物后被激活，切割靶序列生成新的gDNA片段，进而引导切割用于可视化读条的两条LFD探针，从而将扩增信号转换为可检测的探针切割信号。用于可视化读条的两条LFD探针采用端基标记策略，stn探针为5′端6FAM标记且3′端带生物素，tet(X)探针为5′端DIG标记且3′端带生物素；酶切后形成的标记片段在侧向层析试纸条上分别被T1线（红色，对应stn）与T2线（蓝色，对应tet(X)）捕获，C线作为内置质控线保证条带判读可靠，因此可在同一条试纸上同时给出stn与tet(X)的阴阳性组合结果。

图1  双靶标RAA-PfAgo-LFD检测体系原理示意图。

首先，作者根据相应的分子序列设计了扩增引物，并且通过在同一反应体系中同时加入两种模板与两套引物，并对RAA扩增产物进行梯度稀释，随后进入PfAgo切割与试纸条判读步骤，以此来证明该串联体系在双靶标条件下的检出能力。结果显示，不同稀释度下扩增产物仍可获得清晰条带，并且在试纸条上也能直接给出stn与tet(X)的检出结果（图2）。随着模板浓度降低，检测线逐渐减弱，但在10 copies/μL量级仍能观察到有效检测信号，且双靶标并行并未显著牺牲灵敏度，证明RAA的快速富集与PfAgo的程序化识别可协同支撑低拷贝检测。进一步，在真实样本验证中，作者选取了16份混合临床食品样本（包括牛奶、猪肉、鸡肉等）进行检测，其中将沙门氏菌与携带tet(X)质粒的肺炎克雷伯菌或大肠杆菌按1:1比例随机混合作为实验组，以超市购买的牛奶作为阴性对照。通过双重RAA-PfAgo-LFD方法对样本进行直接检测，结果显示该方法能够准确识别出含沙门氏菌和/或tet(X)的样本，试纸条上呈现相应的红色（stn阳性）、蓝色（tet(X)阳性）或双色条带（双阳性），且所有样本的质控线均正常显示，证明反应体系有效（图3A）。为验证该方法的准确性，作者进一步采用传统PCR对同一样本进行检测，结果显示PCR扩增产物与RAA-PfAgo-LFD检测结果完全一致，两者符合率达100%（图3B）。这一结果表明，该双重检测方法在复杂食品基质中同样具有良好的检测准确性和可靠性，能够在45分钟内完成从样本处理到结果判读的全过程，可满足现场快速筛查需求；相较传统培养通常需数天、PCR通常需数小时，整体检测周期明显缩短。

图2  双重RAA-PfAgo-LFD检测系统的检测限验证。

图3  双重RAA-PfAgo-LFD检测系统的实际样本验证。

综上所述，双重RAA-PfAgo-LFD方法通过RAA等温扩增、PfAgo程序化酶切和LFD可视化判读的协同整合，实现了对沙门氏菌及其tet(X)耐药基因的快速、灵敏、特异和现场化检测，为食品安全监测和临床病原筛查提供了一种高效、便捷且无需精密仪器的新型检测工具。其局限在于仍需核酸提取与高温反应条件，样本量与应用场景验证有限，且目前仅覆盖双靶标、结果偏定性。未来可发展一锅式与便携加热模块，推进冻干试剂与简化前处理，扩展多重靶标与定量判读，并在更大规模真实样本中评估稳定性与成本。

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.snb.2025.139237