DNA折纸旋转纳米器件，单分子核酸检测与再生传感

基于DNA折纸的动态结构正在被广泛开发，用于执行包括分子标尺、逻辑门和机械致动器在内的特殊任务。这些器件利用DNA的可编程性和结构精确性，构建了纳米尺度的机制，如行走体、滑块、钳子、铰链和旋转器件。这些概念进一步发展成为更复杂的器件，由一个平面的DNA折纸底座和一个旋转臂组成，实现了器件旋转运动的单分子成像和电控制。此类DNA折纸器件的旋转可以被锁定在选定位置，并具有可重构的潜力。

在这项研究中，我们在早期器件的结构概念基础上，开发了一种可重构的旋转纳米器件，用于连续检测核酸。设计了两个概念验证系统：一个在检测到目标时产生FRET信号的单模式系统，以及一个能够根据结合的目标产生FRET信号或猝灭信号的双模式系统。单模式系统展示了检测单链DNA目标的能力，检测限在低纳摩尔范围内，并能够通过再生实现多轮检测。此外，系统地检查了包括生物测定浓度、孵育时间和延伸定位在内的关键参数，以评估它们对测定响应的影响。双模式系统展示了在多重系统中使用纳米器件的可行性，并确认观察到的信号源自顶部束的旋转。尽管在实现完全连续的生物传感器方面仍存在挑战，但这项工作通过引入概念验证的再生连续系统向前迈进了一步。

研究内容

图1.设计与表征

基于先前涉及旋转DNA折纸器件的工作，我们对其设计进行了修改，以创建可再生的连续生物测定。在我们的方法中，一个14螺旋的顶部束和一个2层扁平片底部折纸结构从同一个圆形支架折叠而成，并通过支架在其中心连接。连接点由两个单链支架区域（3和4个核苷酸）桥接，这使得顶部束具有灵活性，使其能够相对于扁平片围绕支点旋转。原子力显微镜和透射电子显微镜图像支持了这一结论，定量分析表明56%的结构折叠良好，展现出完整的扁平片和一个被切角的矩形顶部束。

图2.传感机制

折叠的纳米结构在其非功能状态下自组装。为了将其转变为可再生的连续生物传感器件，我们利用了顶部束固有的灵活性，使其可以在底部扁平片上旋转。我们延伸了两个订书钉链，其序列设计用于创建纳米器件的不同“开”和“关”构象。此外，我们在延伸末端连接了荧光团，为每种状态产生独特且可检测的信号。因此，发夹倾向于其闭合构象，而不是延伸成线性结构；这维持了以最小FRET为特征的“关”信号。在这种未锁定状态下，顶部束保持动态，并表现出旋转运动。当添加与发夹链一半完全互补的目标链时，发夹开始打开。一旦打开，顶部束仍可旋转，剩余的发夹线性链可以通过链置换结合到捕获-Cy5链上。

图3.单分子水平研究

为了评估固定化系统，从扁平片下侧延伸了八个订书钉，以实现与生物素-TEG-DNA链的杂交。随后，将生物素功能化的纳米器件注入到载玻片上的PEG-生物素-链霉亲和素包被的通道中进行固定。使用基于棱镜的全内反射显微镜设置，依次激发供体和受体，并记录它们的发射。这种方法允许通过匹配供体和受体发射的空间位置在单分子水平上识别纳米器件。随着时间的推移监测单个染料的荧光，从而确定纳米器件的表观FRET。首先监测固定化纳米器件处于“关”状态。将1μM目标链引入通道诱导“开”状态，随后通过添加5μM置换链恢复“关”状态。每种状态的FRET对的时间轨迹表现出不同的特征。在“开”状态下，个体结构在不同FRET状态之间切换更频繁，这从静态分子比例从“关”状态的大约95%减少到“开”状态的约44%可以证明。

图4.双模式系统

为了进一步展示顶部束旋转成不同构象的能力，开发了一种可以检测两种不同目标链的双模式设置。在此设置中，顶部束可以锁定在两个不同的位置：一个产生FRET信号，另一个猝灭Cy3信号。两个系统的操作方式与单模式设置类似，其中发夹的分子内结合通常表现出更强的结合亲和力。只有当目标链结合到发夹并将其打开时，捕获链才会杂交，导致信号变化。为了测试该系统，通过添加目标链1或目标链2，分别将纳米器件切换到FRET状态或猝灭状态，孵育2小时。然后引入相应的置换链，将系统再生回其初始状态。在FRET状态下，添加目标链时检测到FRET信号，并且在引入置换链后，系统可以部分再生到其初始状态。类似地，在猝灭状态下，添加目标链导致猝灭的Cy3信号，在添加置换链后也在一定程度上再生。此外，当引入具有随机序列、预计不会与发夹杂交的目标链时，没有观察到响应。类似地，在FRET状态下引入随机置换链对信号影响很小，证实了系统对目标序列的特异性。

原文链接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acsnano.5c22080