噬菌体-点击酶生物传感平台，快速检测生乳腐败菌

全球消费者日益青睐生鲜乳制品等未经深度加工的天然食品，但这类产品极易受微生物污染。为了克服这些局限，人工纳米酶被开发出来以替代天然酶。其中，基于铜的纳米酶、金属氧化物、MOF衍生催化剂等因其高催化活性、增强的稳定性、可控的合成和低成本，在生物传感中展现出潜力。

荧光生物传感器可实现快速、灵敏的定量检测。然而，抗体、酶等传统识别元件通常不稳定且昂贵。相比之下，噬菌体能以高特异性识别活菌宿主，成本低廉、易于修饰，且对人体安全。重要的是，特异性噬菌体既能检测也能消除细菌污染。点击化学，特别是铜(I)催化的叠氮-炔环加成反应，因其条件温和、高效、选择性好，已被广泛应用于荧光生物传感。然而，许多铜基纳米颗粒需要酸性溶解或添加外部还原剂来生成具有催化活性的Cu(I)，这可能影响检测的准确性。因此，开发一种集高特异性识别、高效信号放大和简便操作于一体的新型检测平台，对实现荧光假单胞菌的现场快速检测具有重要意义。

研究内容

图1.点击酶与点击酶-噬菌体复合物的表征以及CCRN点击酶的催化活性评估

本研究通过水热法合成了CCRN纳米催化剂。扫描电镜和透射电镜显示其呈近球形，平均直径约250nm。元素映射证实Cu、O、N、S元素均匀分布。XRD分析表明其为无定形结构，这归因于不对称的Cys-RGD配体，该结构提供了比晶体催化剂更高的Cu(I)位点可及性，从而增强了催化效率。XPS分析显示，Cu(I)含量高达约87%，且无金属态Cu⁰。高比例的Cu(I)使其无需外部还原剂即可直接催化CuAAC反应。S2p谱图显示存在S-Cu配位，表明CRGD配体壳层有效稳定了Cu(I)。CCRN表面丰富的羧基、酰胺和羟基官能团促进了其在水介质中的分散，并有利于通过EDC/NHS化学与噬菌体偶联。FT-IR光谱证实了CCRN与噬菌体之间成功形成酰胺键，产生了CCRN@Phage特异性识别探针。

在395nm激发下，产物在475nm处有强荧光发射。实验表明，单独的底物（炔2和叠氮1）混合几乎不产生荧光，加入CCRN后则产生强荧光信号，证实其良好的催化效率。与在还原条件下传统Cu(II)离子相比，在相同铜离子浓度下，CCRN表现出显著增强的催化活性。CCRN在不同pH缓冲液中孵育10小时后仍能保持超过50%的初始活性，并显示出高热稳定性。

图2.分析条件的优化及性能评估

ConA@Fe₃O₄的浓度优化至500μg/mL，超过此浓度会因空间位阻导致荧光强度下降。ConA@Fe₃O₄的富集时间在15分钟时达到平台。CCRN@Phage探针的最佳浓度和催化点击反应时间分别为1mg/mL和40分钟。与需要外部还原剂或酸溶解的传统CuO或Cu-MOF纳米酶不同，富含Cu(I)的CCRN无需额外步骤即可高效催化反应，简化了流程。

荧光信号随荧光假单胞菌浓度（0-10⁸CFU/mL）增加而逐步增强。在PBS缓冲液中，方法的检测限低至1CFU/mL，在10²-10⁷CFU/mL范围内呈良好的线性关系。在生乳、UHT奶、巴氏杀菌奶等复杂乳基质中，检测限也约为1CFU/mL，证明其抗基质干扰能力强。特异性测试表明，该方法对蜡样芽孢杆菌、肠炎沙门氏菌、大肠杆菌、单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌等五种非目标食源性病原体无显著交叉反应。此外，将该方法与qPCR方法对相同真实和自然污染样品进行比对，两种方法的结果具有良好的一致性。

本研究成功开发了一种结合噬菌体识别、ConA@Fe₃O₄磁富集和CuAAC催化的CCRN点击酶荧光检测方法，用于乳品中荧光假单胞菌的快速、灵敏、特异性检测。该方法检测限低至1CFU/mL，线性响应范围为10²-10⁷CFU/mL，并在生乳、UHT奶和巴氏杀菌奶等真实基质中表现出可靠的性能。其高性能源于富含Cu(I)的CCRN点击酶（无需额外还原剂或溶解步骤即可高效催化CuAAC反应）以及ConA@Fe₃O₄富集与CCRN@Phage识别的结合。该方法已成功应用于乳样品检测，证实了其在现实世界食品安全监测中的稳健性和适用性。总体而言，这项工作为检测荧光假单胞菌提供了一种低成本、可持续且高效的荧光生物传感策略。

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.bios.2026.118406