随着食品安全问题日益受到关注，食源性疾病已成为全球公共卫生的重要负担，其中细菌性食源性疾病更为常见，因此，快速、准确地区分不同致病菌，尤其是复杂混合样本中的细菌类型，对污染筛查、质量监测和溯源防控都具有重要意义。但传统培养、生化分析和基因检测往往存在流程复杂、耗时长、样本需求大和成本高等问题，而依赖特异性识别元件的“锁钥式”传感方法在面对多组分混合体系时又灵活性不足。基于此，利用化学鼻的交叉反应模式识别能力，并结合荧光小分子底物对细菌代谢酶活性的响应，构建一种低成本、易扩展、适合复杂样本分析的新型识别平台，具有明确的研究必要性和现实应用价值。

一、工作原理

本研究的工作原理是将细菌代谢过程中与酶活性相关的差异，转化为可测量、可分析的荧光信号。如图1所示，研究者以4种商业可得的4-MU衍生物构建多通道荧光传感阵列，包括MUB、MUG、MUGlu和MUGal。细菌与探针接触后，其代谢相关酶会对不同底物发生差异性水解，当4-MU衍生物被切割后释放出4-MU，产生增强的蓝色荧光，并可通过荧光分光仪直接检测。由于不同菌种在代谢酶种类和表达水平上存在差异，因此会对4个探针产生不同强度的响应，最终形成具有菌种特征的多维“代谢指纹”。这些多通道荧光响应会进一步作为整体输入后续算法，实现细菌分类识别。

图1  4-MU荧光传感阵列介导的细菌识别原理示意图。

二、方法性能

（1）单重识别

如图2所示，9种食源性细菌在4个荧光通道上的响应强度存在明显差异，说明各菌株对4种底物的酶促水解能力不同。同时，这些差异能够形成稳定且可重复的交叉反应热图，并被整理为4维荧光指纹数据库。进一步，利用PCA对高维信号进行降维，前两个主成分共解释63.9%的总方差，说明该阵列已经能够有效捕捉不同细菌的主要代谢差异。最后，通过LDA对这些指纹进行监督判别，结果显示9种细菌形成彼此分离、互不重叠的独立簇，交叉验证准确率达到100%。这说明该方法的本质并不是依赖单一特异性识别元件，而是通过多通道交叉响应读取细菌整体代谢特征，再借助模式识别完成精准分类。

图2  4-MU荧光传感阵列对9种细菌的响应特征及判别分析。

（2）单重浓度识别

如图3所示，该方法在同一种细菌内部具有两方面能力：既能区分不同浓度水平，又能建立浓度相关的定量关系。作者以E. coli O157:H7和S. aureus为代表，记录了不同浓度下4个传感单元的荧光响应。结果显示，随着细菌浓度升高，细菌代谢产生的相关酶增多，4种探针被水解得更充分，因此阵列荧光强度与细菌浓度呈正相关，热图也表现出具有规律性的变化趋势。进一步地，LDA结果显示，不同浓度样本能够形成显著分离的簇，并且随浓度升高整体向同一方向迁移，说明阵列信号能够稳定反映浓度差异。由于Factor 1在LDA中解释了95%以上的信息，作者进一步以Factor 1作为浓度表征指标，建立了其与细菌浓度之间的线性关系，其中E. coli O157:H7和S. aureus的R2分别达到0.991和0.996。

图3  4-MU荧光传感阵列对不同浓度大肠杆菌O157:H7和金黄色葡萄球菌的响应及判别分析。

（3）两重混合样本识别

作者首先构建了两类双菌混合模型，包括以大肠杆菌O157:H7与其他菌株组成的复合样本以及多种随机配对的双菌组合，并在OD600=0.01条件下与4个荧光探针反应（图4A、B）。不同双菌组合可产生彼此可区分的复合代谢指纹，LDA可将各类双菌样本清晰分离为互不重叠的独立簇，交叉验证准确率达到100%（图4C、D），说明该阵列能够识别共培养体系的综合代谢特征，而非单一菌株信号。进一步地，作者选取大肠杆菌O157:H7与粪肠球菌建立固定双菌体系，通过设置不同比例发现阵列呈现比例依赖型荧光响应（图5A、B）；LDA显示不同配比样本可被有效区分（图5C），且Factor 1与大肠杆菌O157:H7占比呈良好线性关系（R2=0.961）（图5D）。这表明该方法不仅能够识别不同类型的双菌混合样本，还可在固定菌对前提下对组成比例进行半定量判别，体现出其在混合污染识别和复杂混合样本分析中的应用潜力。

图4  双菌混合样本的荧光响应聚类特征及线性判别分析。

图5  不同配比大肠杆菌O157:H7与粪肠球菌混合样本的荧光响应及判别分析。

（4）实际样本应用能力

为验证方法在真实食品基质中的适用性，作者将9种细菌加入经1000倍PBS稀释的牛奶样本中进行检测。图6A显示阵列在牛奶基质内仍产生可区分的多通道荧光响应，图6B表明不同菌株仍可形成稳定的特征指纹，图6C进一步显示空白牛奶与各加菌样本可被清晰区分，并实现100%的分类准确率。这说明该方法具有较强的抗基质干扰能力和实际食品检测潜力。

图6  牛奶基质中9种细菌的4-MU荧光传感阵列响应及判别分析。

综上，作者提出了一种以细菌代谢酶活为识别基础的化学鼻策略，利用商业化4-MU衍生物构建低成本、易扩展的多通道荧光阵列，减少了对特异性生物识别元件和复杂探针合成的依赖，使细菌识别从单一菌种区分拓展到预设双菌混合样本判别与实际食品基质应用，体现出较好的方法创新性与食品安全应用潜力。但当前验证范围仍主要集中于9种细菌、预设双菌组合及固定比例体系，且实际样本仅拓展到经稀释预处理的牛奶，后端判别也依赖有标签样本训练的LDA模型，因此对更复杂天然污染样本和完全未知多菌体系的泛化能力仍需进一步证明。未来可进一步扩展菌种谱和食品基质类型，增强对真实混合污染的定量解析能力，并发展更适用于复杂未知样本的建模策略，推动标准化与便携化发展，以提升其现场快速筛查的实用价值。

原文链接：https://doi.org/10.1021/acs.analchem.5c07248