诺如病毒现场快检新突破：冻干纸基 RT‑RPA‑CRISPR 平台 45 分钟精准检出

研究背景

诺如病毒是全球急性非细菌性肠胃炎的首要病原体，也是食源性疾病暴发的主要诱因，具有传播性强、感染剂量低、环境稳定性高等特点，对公共卫生与食品安全构成持续威胁。传统定量PCR等检测方法依赖昂贵仪器、专业人员且流程繁琐，难以满足资源受限场景与现场快速筛查需求。

近年来，CRISPR/Cas系统凭借高特异性与信号放大能力成为核酸检测热点，其中 Cas12a 在识别靶标后可激活反式切割活性，实现灵敏信号输出。但现有CRISPR联合扩增技术多为试管反应，操作复杂、试剂易失活，纸基诊断虽具低成本、便携优势，却仍面临试剂稳定性不足、集成度不高等瓶颈。为此，研发集扩增、识别、信号输出于一体、可室温长期保存的一体化现场检测平台，成为诺如病毒防控的迫切需求。

研究内容

研究团队构建冻干纸基微流控分析装置（μPAD），将RT‑RPA与CRISPR/Cas12a反应体系整合于单一纸芯片，并配套开发智能手机辅助便携式荧光检测设备，实现从核酸扩增到结果判读的全流程一体化。

1.纸芯片制备与试剂冻干：采用Whatman No.1滤纸构建双层结构，下层为疏水支撑层，上层为两个亲水反应区，分别承载RT‑RPA与CRISPR/Cas12a冻干试剂。以甘露醇+蔗糖为冻干保护剂，经−80℃预冻、−90℃真空冻干，将反应试剂原位固定于纸基。

2.检测流程：样本RNA与乙酸镁混合液滴加至RT‑RPA反应区，37℃孵育15分钟完成反转录与等温扩增；折叠芯片使扩增产物与 CRISPR/Cas12a 区接触，37℃反应30–60分钟激活Cas12a反式切割，释放荧光信号；通过智能手机装置读取并定量荧光强度。

3.性能验证：系统评估平台的灵敏度、特异性、室温稳定性，并在自来水、生菜、牡蛎等实际样本中与RT‑qPCR进行方法比对。

图1. 用于诺如病毒检测的lpRPA-Cas平台示意图。(A) lpRPA-Cas平台的检测过程。(B) lpRPA-Cas平台的检测机制，包括RT-RPA反应、CRISPR/Cas12a反应和信号输出。

图2. 纸芯片的制备与表征。 (A) 示意图说明液体试剂在纸芯片上的冻干过程。 (B) 制备好的纸芯片照片。 (C-E) 扫描电子显微镜(SEM)图像：空白的Whatman No. 1 定性滤纸 (C)；装载RT-RPA试剂的冻干纸 (D)；以及装载CRISPR/Cas12a试剂的冻干纸 (E)。 (F-H) 能谱(EDS)图谱：空白的Whatman No. 1 定性滤纸 (F)；装载RT-RPA试剂的冻干纸 (G)；以及装载CRISPR/Cas12a试剂的冻干纸 (H)。

图3. 所提出平台的可行性与优化。(A) 使用不同RPA引物的RPA-CRISPR反应的荧光强度和信噪比。(B, C) 用于评估CRISPR系统中不同crRNA性能的荧光动力学(B)及50分钟荧光强度(C)。(D) 保护剂的优化。(E, F) 不同纸基材的背景荧光(E)及检测性能(F)比较。(G) 可行性测试及Cas12a浓度优化。(H) CRISPR/Cas12a切割反应时间的优化。Δ强度通过测量荧光强度减去背景荧光计算。n = 3 技术重复；柱状图表示平均值 ± 标准差。

研究结果

1.检测灵敏度：对诺如病毒RNA检出限低至1拷贝/μL，荧光强度与病毒RNA浓度在10⁰–10⁸拷贝/μL范围内呈良好线性关系（R²=0.946），可实现准确定量。

2.检测特异性：对沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、新冠病毒、轮状病毒及人基因组DNA等无交叉反应，仅对诺如病毒产生强荧光信号，特异性优异。

3.储存稳定性：冻干纸芯片在室温（约25℃）可稳定保存8周，37℃加速条件下仍可保持7天高活性，满足现场储运需求。

4.实际样本适配性：在自来水、生菜、牡蛎等加标样本中检测灵敏度仍达1拷贝/μL；对9份市售牡蛎样本检测，与RT‑qPCR结果100% 一致，可准确检出Ct值 > 35的低丰度阳性样本。

5.检测时效：全程仅需45分钟，无需大型仪器，操作简便，适配现场快速检测。

图4. 平台用于诺如病毒RNA检测的性能。(A-C) 平台在CRISPR/Cas12a反应过程中不同时间点对诺如病毒RNA检测的灵敏度。(D) 荧光强度与诺如病毒RNA浓度的相关性。(E) 平台对诺如病毒检测的选择性，相较于其他干扰病毒、细菌、真菌和人体细胞。(F) 冻干纸基RPA-CRISPR检测诺如病毒RNA（1拷贝/μL）的稳定性和保质期评估，为期八周。n = 3 技术重复；柱状图表示均值 ± 标准差；双尾Student's t检验；*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001.

图5. lpRPA-Cas平台在实际样品中检测诺如病毒（NoV）的应用。(A) 环境和食品样品中NoV检测的工作流程。(B-D) 含不同浓度NoV RNA的加标样品在自来水(B)、生菜(C)和牡蛎基质(D)中的检测结果。(E) 牡蛎消化腺及其匀浆的照片。(F) lpRPA-Cas平台与RT-qPCR在检测9个牡蛎样品（包括6个阳性和3个阴性样品）中NoV的性能对比。(G) lpRPA-Cas平台与RT-qPCR检测结果的韦恩图比较。n = 3 技术重复；柱状代表平均值 ± 标准差；双尾Student's t检验；*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001.

图6. 便携式设备的性能分析 (A) 便携式智能手机辅助设备的示意图。(B) 便携设备的照片。(C) 使用便携设备检测不同浓度NoV RNA的荧光强度结果。(D) 便携设备荧光强度与实验室设备荧光强度的线性关系。(E) 使用便携设备检测的9个牡蛎样品的荧光强度。FI: 荧光强度；误差线表示三次实验结果的标准差 (n = 3)。统计显著性通过双尾非配对Student t检验获得: NS, P > 0.05; ***, P < 0.001.

技术优势

1.高度集成与便携：全反应集成于2 cm×1 cm纸芯片，配套智能手机装置尺寸仅90 mm×60 mm×50 mm，成本约 45 美元，无需冷链与专业设备。

2.试剂稳定易用：冻干技术消除试剂降解风险，室温长期稳定，使用时仅需复水，大幅降低操作门槛。

3.高灵敏高特异：RT‑RPA等温扩增与CRISPR/Cas12a精准识别结合，兼顾快速扩增与序列特异性，检出限媲美qPCR。

4.智能定量判读：智能手机捕获荧光图像，通过ImageJ软件自动分析，既可肉眼定性判断，也可精准定量，结果客观可靠。

5.样本兼容性强：耐受自来水、生菜、牡蛎等复杂基质干扰，适用于环境与食品多场景检测。

结论与展望

本研究成功开发集成RT‑RPA与CRISPR/Cas12a的冻干纸基检测平台，实现诺如病毒快速、超灵敏、高特异、室温稳定的现场即时检测，在实际食品与环境样本中表现与RT‑qPCR高度一致，且具备低成本、易操作、便携化等突出优势，为诺如病毒暴发防控、食品安全监管与环境监测提供强有力技术支撑。

该平台设计思路具有通用性，通过更换引物与crRNA，可快速拓展至其他食源性致病菌、病毒等病原体检测，在食品安全、公共卫生、基层疾控等领域具备广阔应用前景。未来研究将进一步简化核酸提取步骤，整合微型化提取模块，推动平台向更简便、更快速、全集成方向发展，助力构建覆盖多场景的病原微生物现场检测体系。

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.cej.2026.172832