把96孔板变成蛋白工厂：AutoDEP开启蛋白组学前处理新路径

合成生物学的发展日益依赖“设计、构建、测试、学习”的迭代框架，而其中对底盘细胞蛋白调控网络的系统解析，离不开高质量、可规模化的蛋白组学数据支撑。蛋白样品前处理是蛋白组学流程中的关键限速环节，传统方法高度依赖人工操作，不仅耗时耗力，在大规模研究中还容易带来批次波动、数据一致性下降和成本上升，因此建立自动化前处理平台已成为获得稳定、高通量蛋白组学数据的现实需求。尤其在工业微生物场景中，这一需求更为迫切。由于工业微生物往往具有更稳固的细胞结构，常需采用更强的裂解体系；而SDS等裂解试剂虽具有较高蛋白提取效率，却会干扰后续酶解与质谱分析，形成前处理中最突出的技术瓶颈。现有S-Trap方法虽能有效去除SDS并简化流程，但成本较高，限制了其在大规模应用中的推广。

一、工作流程

本研究提出了一种兼顾低成本、高通量、自动化和广泛适配性的样品制备策略，AutoDEP。其工作流程如图1所示：首先，将经浓度归一化的菌体裂解液转移至96孔PCR板，并借助Biomek i7液体处理平台完成样本转运；随后在自动热循环模块中依次进行蛋白还原与烷基化处理，酸化后加载至96孔DNA提取板，在正压过滤模块作用下完成蛋白纯化；继而将纯化后的样品在37℃条件下进行过夜胰酶酶解，所得肽段经回收后进入HLB 96孔板脱盐，最终获得可用于LC-MS/MS检测的洁净肽段。

图1  AutoDEP自动化高通量蛋白组学样品制备流程。

二、方法性能

（1）重复性和稳定性

研究以谷氨酸棒杆菌裂解液为样本，在连续3天内分批处理6块96孔板，每天处理2块，每板随机选取5个孔，共获得30份样本进行LC-MS/MS分析。图2结果表明，各样本的蛋白鉴定数量整体稳定，平均约为2105个，同时零漏切比例超过81%，说明该流程在酶解质量和蛋白回收方面具有良好一致性。进一步分析显示，不同样本间肽段信号强度分布高度相近；板内重复的蛋白定量CV中位数为4.57%至7.11%，均值为6.8%至9.26%，表明板内波动较小；按天汇总进行板间比较时，3天中均有超过91%的蛋白CV低于20%，且CV中位数分别为6.24%、7.44%和7.02%。此外，30份样本之间的蛋白强度相关性均较高，Pearson相关系数R平方均在0.97以上。由此，AutoDEP在板内重复、板间重复以及跨天重复方面均表现出较高的精密度和稳定性，能够为大规模蛋白组学样品前处理提供可靠且可重复的技术支撑。

图2  AutoDEP在板内、板间及跨天处理中的重复性评估。

（2）上样量兼容性

如图3所示，在低输入范围内，随着蛋白上样量由1 μg增加至20 μg，蛋白鉴定数量总体上升并趋于稳定；其中，5 μg样本平均可鉴定约2071个蛋白，已接近常规50 μg输入水平，而1 μg条件下仍可鉴定约1784个蛋白，说明该方法具备一定的微量样本处理能力。同时，低输入条件下零漏切比例有所下降，且蛋白定量变异系数随上样量增加而逐步降低；当输入量达到5 μg及以上时，中位CV可降至8.54%以下，表明方法在该范围内已具有较好的定量重复性。在高输入范围内，SDS-PAGE结果表明，50 μg和200 μg加载条件下流出液中几乎无明显蛋白条带，提示样品可被有效截留；而当加载量提升至500 μg和1000 μg时，流出液中开始出现明显蛋白信号，且以低分子量蛋白更易溢出，说明超出载量上限后会发生部分泄漏。总体来看，AutoDEP具备从1 μg微量样本到至少200 μg较高载量的处理能力，但若用于常规定量蛋白组学分析，建议蛋白输入量保持在5 μg以上，并根据样本量适当优化酶解体积或胰酶用量。

图3  AutoDEP在低输入与高输入条件下的处理能力评估。

（3）方法比较

为全面评估AutoDEP的实际性能，研究进一步将其与两种常用手工前处理方法FASP和ISD进行对比，并分别设置5次重复实验。如图4所示，三种方法在蛋白组覆盖深度上总体相近，其中FASP平均鉴定2140种蛋白和20372条肽段，ISD平均鉴定2107种蛋白和21375条肽段，而AutoDEP平均可鉴定2148种蛋白和21894条肽段，整体表现与传统方法相当。与此同时，三种方法的肽段零漏切率均高于80%，说明AutoDEP在酶解效率上并未因自动化而降低。进一步的重叠分析显示，三种方法共有蛋白占比达96.9%，提示AutoDEP在蛋白鉴定范围上与经典方法高度一致。定量重复性分析进一步表明，AutoDEP中95%的定量蛋白CV低于20%，优于FASP和ISD，显示出更低的技术波动。相关性分析也表明，不同方法间蛋白信号强度的Pearson相关系数R平方均大于0.97，说明三种流程在定量结果上具有较高一致性。

图4  AutoDEP与FASP和ISD的性能比较。

总体来看，AutoDEP通过整合SDS裂解、96孔DNA提取板与自动化液体处理系统，提出了一条面向工业微生物的低成本、高通量、可标准化蛋白组学前处理新路径，其方法学创新性主要体现在利用常规商用耗材实现了可推广的自动化流程。同时，该方法仍存在未完全无人化、部分步骤仍需人工封板或转移至孵育设备等局限；对于低输入样本，后续仍需进一步优化酶解体积和胰酶用量，以降低漏切、提升处理稳定性。未来若进一步补齐封板与恒温孵育等自动模块，并持续拓展至乙酰化、磷酸化等翻译后修饰分析以及蛋白互作研究，AutoDEP有望发展为更完整的规模化样品制备平台。

原文链接：https://doi.org/10.1021/acs.analchem.5c06568