细菌先别“报名字”，先站队：全血快速革兰分型来了

败血症是由感染诱发的宿主反应失调所导致的危及生命的器官功能障碍，具有高发病率、高死亡率和高医疗负担等特点。在细菌性败血症的早期处置中，临床往往需要尽快判断致病菌的基本类型，以便及时调整抗菌治疗方案。然而，现有金标准流程通常仍依赖先进行血培养，再开展革兰染色、PCR鉴定及药敏分析，整个过程常需1至5天，难以及时为精准用药提供支持。由于结果滞后，医生通常只能先行使用覆盖革兰阳性菌和革兰阴性菌的广谱抗生素，这种经验性治疗虽然必要，却可能增加抗菌药物滥用、耐药风险及患者不良结局；更重要的是，文中指出，恰当治疗每延迟1小时，患者死亡风险可增加4%至9%。在此背景下，能够绕过血培养、直接从全血中快速获得革兰分型信息的检测技术，具有突出的临床价值和现实必要性。尽管已有部分无培养检测方法被提出，但仍普遍存在检测面板有限、设备成本高、推广受限，或仍需核酸提取纯化等问题，尚难同时兼顾速度、灵敏度、成本和可及性。因此，本研究围绕“尽早获得足以指导经验性用药的关键信息”这一临床需求，尝试构建一种更快速、更简化、且可直接用于全血样本的革兰分型策略，其意义不仅在于缩短检测链条、提升早期诊疗效率，也在于为败血症患者争取更宝贵的干预时间，并为后续发展更高通量、更高灵敏度的床旁分子诊断平台奠定基础。

一、设计原理

如图1所示，本研究的核心设计，本质上就是“序列差异驱动的特异扩增”与“双相处理支持的直接检测”相结合：前者负责分清革兰阴性或阳性，后者负责让检测跳过血培养和提取纯化，从而把传统需要1至5天的分型流程，压缩到约1.5小时内完成，为败血症早期经验性用药提供更快的依据。

在引物设计方面，研究者先对目标菌的16S rRNA序列进行比对，寻找在一类细菌中相对保守、而在另一类细菌中存在错配的特征区域，并将这些“特异性差异”布置在F1c的5′端或F2的3′端等关键位置，以此区分革兰阴性菌和革兰阳性菌。

在信号判读层面，作者采用DARQ技术构建双重LAMP检测体系，其中革兰阴性菌对应的DARQ FIP探针标记ROX荧光，革兰阳性菌对应的DARQ FIP探针标记Cy5荧光。扩增过程中，只有当Bst聚合酶发生链置换并释放淬灭结构时，才会产生对应荧光信号，因此ROX通道扩增提示革兰阴性菌存在，Cy5通道扩增提示革兰阳性菌存在，而两通道同时出现信号则提示可能存在革兰阴性菌和革兰阳性菌共感染。

在样本处理层面，图1A下半部分展示了本研究的另一关键创新，即双相样本处理策略。研究中并不先做血培养，也不进行常规核酸提取和纯化，而是将4 μL全血快速干燥形成多孔的“blood cake”固相结构，使血液中的抑制物被尽量困在固相内，同时保留样本中的目标DNA；随后，液相中的聚合酶、引物和dNTP向固相扩散，在其中完成扩增，生成的扩增产物再扩散回液相进行荧光检测。通过这种“固相保留样本、液相完成反应与读出”的设计，体系在减少抑制效应的同时，最大限度保留了目标核酸，也因此能够绕开传统提取纯化步骤，直接从全血获得革兰分型信息。

图1  全血直接革兰分型的双相双重DARQ-LAMP检测流程及引物设计原理。

二、检测性能

所建立的方法在全血中具备较高灵敏度。如图2所示，与Qiagen提取法相比，双相法虽在扩增速度上略慢，但前处理仅需30至40分钟，明显短于Qiagen约80分钟；其对E.coli的检出限为5 CFU/μL，对MSSA为1 CFU/μL，整体定量范围可覆盖1至5000 CFU/μL。如图3所示，该体系在复杂样本中仍具有良好特异性：单重检测对非靶标DNA无非特异扩增，双重检测中革兰阴性菌仅在GN通道扩增，革兰阳性菌仅在GP通道扩增，混合样本则双通道同时阳性；在整菌加血验证中，灵敏度仍保持1至5 CFU/μL，说明其兼具检测能力、分型准确性和临床应用潜力。

图2  Qiagen提取纯化法与双相样本处理法在全血中对E. coli和MSSA双重DARQ-LAMP检测性能的比较。

图3  双相双重DARQ-LAMP在全血中的特异性验证及混合感染识别。A、B部分显示，单重GN或GP引物-探针体系在对侧菌群非靶DNA（1000、100、10、1、0 copies/μL）条件下均无非特异扩增。C部分显示，在全血中加入接近检出限的100 copies/μL目标DNA时，革兰阴性菌仅在GN通道扩增，革兰阳性菌仅在GP通道扩增，七种细菌DNA共存时双通道同时阳性。D部分进一步以整菌加血验证，在100、50、5、1 CFU/μL下仍可实现1至5 CFU/μL灵敏度，并可识别混合感染。

综上，该研究表明，双相样本处理联合DARQ-LAMP可在无需血培养及常规核酸提取纯化的前提下，直接对全血中的目标菌进行革兰阳性或阴性快速分型，为败血症早期经验性用药提供了更高效的检测思路，其创新性在于将全血直检、双通道荧光判读与简化前处理整合于同一体系，并在较短时间内输出具有临床意义的分型信息。但该方法目前仍处于概念验证阶段，主要适用于预设菌群的革兰类别区分，尚不能替代菌种鉴定和后续药敏检测。同时，双相体系依赖液相中的聚合酶、引物和dNTP向固相扩散，并依赖扩增产物再扩散回液相完成光学检测；文中证明了这一设计可行，但并未进一步对该传质过程的动力学特征、扩散稳定性及其对不同样本背景的影响进行系统量化，这也可能是其相较提取法在部分目标上扩增更慢或灵敏度略低的潜在原因之一。未来可结合更大体积血样输入与微流控平台优化，在提升传质一致性、检测通量和灵敏度的同时，推动其进一步向临床转化。

 原文链接：https://doi.org/10.1021/acssensors.5c04177