三重滚环扩增助力，DNA智能水凝胶实现超敏多元检测

血液中的生物标志物（如蛋白质、细胞、细菌等）是了解人类疾病（包括代谢综合征、肿瘤和感染）的关键。对其实现无创、快速、动态的定量检测，对于及时干预、优化治疗策略和监测疾病进展至关重要。目前，临床实验室最常用的免疫分析技术虽然不断改进，但仍面临操作复杂、抗体/酶成本高、潜在交叉反应以及通常只能单靶标检测等挑战。因此，亟需设计能够超越抗体依赖性机制、广泛适用于多种靶标的直观检测策略。

适配体因其高重现性、易于合成和高亲和力等优点，是构建生物传感器的理想识别探针。DNA纳米材料，特别是DNA水凝胶，凭借其形状适应性、高表面积的多孔结构、易于功能化、稳定性好以及对特定分析物的响应性，在生物传感领域展现出巨大潜力。本研究将适配体的特异性识别能力、DNA水凝胶的结构可编程性以及量子点的优异荧光信号输出能力相结合，旨在开发一个集信号识别与输出于一体的、通用型、高灵敏的“样本输入-信号输出”传感平台，以推动精准诊断的发展。

研究内容

图1.基于DNA水凝胶/QDs的通用靶标响应性检测

传感器核心是通过三重平行滚环扩增（RCA）制备的DNA水凝胶，其中DNA同时作为结构交联单元、识别元件（通过互补序列锚定适配体）和量子点（QDs）的封装位点。当不存在靶标时，加入的适配体会结合到水凝胶的互补序列上，引发链置换反应，导致水凝胶结构部分解体，释放出封装的QDs，产生荧光信号。而当靶标存在时，适配体优先与靶标结合，从而阻碍了适配体诱导的水凝胶解体过程，导致释放的QDs减少，荧光信号与靶标浓度呈负相关。通过程序化设计DNA序列，该平台可适配不同的适配体，从而实现多种生物标志物的检测。

图2.三重平行滚环扩增辅助的DNA水凝胶/QDs的构建与表征

通过琼脂糖凝胶电泳和原子力显微镜（AFM）验证了三重RCA的成功进行。流变学测试（储能模量G‘>损耗模量G“）和扫描电镜（SEM）图像证实了水凝胶的成功形成及其三维多孔结构。透射电镜（TEM）、紫外吸收和荧光光谱等结果表明CdTe量子点被成功封装于水凝胶中，封装效率高达99.05%。

图3.以IGF-1为例的DNA水凝胶/QDs形成与传感应用

通过粒径和表面电荷测量，证实了适配体的加入会破坏水凝胶结构，而IGF-1的存在会抑制这一过程。在优化条件后，传感器对IGF-1的检测显示出优异的性能，在10-10⁴fg/mL范围内呈良好线性关系，检测限低至飞克每毫升级别。选择性实验表明，传感器对IGF-1具有高特异性，非靶标蛋白的干扰信号与空白相近。

图4.IGF-1水平的临床验证及其与肌肉减少症严重程度的关系

将平台应用于66例临床血清样本的结果显示，IGF-1水平与肌肉减少症的严重程度呈负相关，且在不同疾病分期（健康对照组vs.患者组，不同严重程度患者组间）存在显著统计学差异。受试者工作特征（ROC）曲线分析显示，该平台诊断肌肉减少症和严重肌肉减少症的曲线下面积（AUC）分别达到0.90和0.80。

图5.非小细胞肺癌中PD-L1及外泌体的检测

向程序性死亡配体1（PD-L1），并实现了从蛋白、外泌体到细胞的多层次检测。通过重新编程水凝胶中的DNA序列以匹配PD-L1适配体，平台成功检测了游离PD-L1蛋白，线性范围宽，检测限低至0.6fg/mL，且特异性良好。随后，平台成功应用于检测A549肺癌细胞来源的外泌体，表征确认了外泌体的典型形态和PD-L1等标志蛋白的表达。

图6.液体活检在NSCLC中检测A549细胞的临床应用

在20例临床样本（15例NSCLC患者和5例健康供体）的验证中，患者组与健康组的荧光信号存在极显著差异，ROC分析的AUC高达0.97，显示出卓越的区分能力。检测结果与患者的病理学和计算机断层扫描（CT）图像结果高度一致，证明了该平台作为辅助NSCLC诊断可靠工具的潜力。

图7.使用DNA水凝胶/QDs平台灵敏检测血流感染病原体

以肺炎克雷伯菌（Kp）和大肠杆菌（E.coli）为主要目标。传感器对Kp的检测在10-10^4CFU/mL范围内呈线性，检测限低至6CFU/mL，并表现出良好的特异性。在加标血样中的回收率在105.2%至107.7%之间。对15例阳性血培养瓶样本和5例健康对照的检测显示，患者组荧光信号显著高于对照组，ROC分析的AUC为0.95。与临床微生物实验室的MALDI-TOFMS鉴定和菌落计数结果相比，该方法的一致性达到90%。

本研究成功开发了一种基于DNA水凝胶/量子点（QDs）的新型、通用型生物传感平台。该平台通过三重平行滚环扩增（RCA）快速构建可编程的DNA水凝胶网络，将靶标识别（适配体）与信号输出（QDs荧光）功能整合于单一基质中。其工作原理基于适配体-靶标结合对水凝胶结构解体的调控，实现“信号关闭”式检测，荧光信号与靶标浓度负相关。该平台表现出卓越的灵敏度（检测限达fg/mL级）和特异性，检测流程简化，全过程约1小时。通过对106例临床样本的验证，该平台成功应用于肌肉减少症（IGF-1蛋白）、肺癌（PD-L1蛋白、外泌体、CTCs）和血流感染（细菌）等多种疾病的生物标志物检测，总体准确率达86.8%。尽管在检测细胞、外泌体等复杂靶标时仍需样本前处理，且其应用受限于已报道适配体的可用性，但DNA框架固有的可编程性使其能快速适配新靶标，展现了其在即时检验和下一代精准诊断中的巨大潜力。

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.cej.2025.170809