给细菌做“彩色点名”：结构色条码如何实现精准多重检测

尿路感染等疾病的早期诊断高度依赖高灵敏、多重化的核酸检测，但传统qPCR、Sanger测序和FISH等方法通常需要较大样本量，即便部分快速检测平台也仍难同时兼顾灵敏度与低样本消耗。数字核酸扩增通过在扩增前对单个核酸分子进行物理分隔，可实现痕量靶标的绝对定量，并显著降低初始样本需求；其中dRPA还能在恒温条件下快速完成低拷贝检测，因而很适合即时检测场景。但现有dRPA在多靶标检测时往往仍需多组平行反应，导致耗时、耗材增加，扩展性也受限。基于这一瓶颈，本研究将结构色条码、超亲水多孔阵列与固相dRPA整合，既提高多重识别能力，又减少条码间交叉干扰，从而为尿路感染病原菌提供一种更省样本、更高效、也更具临床转化潜力的检测新方案。

一、工作原理

该平台首先将带有荧光基团和淬灭基团的exo probe固定在不同结构色条码表面。当目标核酸存在时，exo probe与扩增产物特异性结合后，其可切割位点被识别并切开，使荧光基团与淬灭基团分离并恢复信号。随后，不同颜色且携带特异探针的条码被装载到超亲水多孔阵列的独立微孔中，反应液可快速填充各孔，使每个微孔成为独立反应单元。最终通过结构色实现靶标编码识别，通过荧光信号判断是否检出，从而完成多重检测与核酸定量（图1）。

图1  结构色条码集成超亲水多孔阵列的多重核酸检测原理示意图。

二、方法性能

该方法的性能优势主要体现在编码稳定性、扩增效率、定量能力和多重特异性四个方面。首先，结构色条码可形成清晰可区分的三种光学编码，反射峰分别为624 nm、510 nm和491 nm，且其表面由单分散二氧化硅纳米颗粒周期有序排列构成，装入多孔阵列后仍能保持独立固定，说明其具备稳定的编码与载体功能（图2a-f）。在此基础上，固相RPA体系经过系统优化后表现出良好的扩增响应：探针修饰30 min后信号趋于稳定，BSA封闭1 h后可有效降低非特异吸附，30个T碱基间隔可明显减轻空间位阻，exo probe最佳浓度为1 μM；在最优条件下，扩增后荧光信号较扩增前提升约10倍，且对铜绿假单胞菌DNA的检测下限可达0.1 nM，在0.1至100 nM范围内具有良好线性，线性相关性良好（R²≥0.94）（图3a-f）。进一步地，在数字定量层面，阴性对照中未见阳性孔，说明体系无明显污染；依据阳性孔判定和泊松统计分析，平台可实现1至100 copies/μL范围内的绝对定量，实验测得浓度与真实浓度高度一致，线性拟合R2=0.9973，并可低至1 copy/μL检测，表明其具有较高的定量准确性与可靠性（图4a,b）。最后，在多重检测方面，红、绿、蓝三种条码分别用于识别铜绿假单胞菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌，只有对应靶标存在时，相应条码才出现荧光恢复；统计结果进一步证明了良好的选择性，且在双靶和三靶混合样本中仍无明显交叉干扰，说明该方法具备稳定的多重筛查能力（图5a,b）。

图2  结构色条码的光学编码特征、表面形貌及其在多孔阵列中的装载表征。a-c，三种结构色条码，反射峰分别为624 nm、510 nm和491 nm；d，条码表面有序组装结构的SEM图；e，三种条码对应的反射光谱；f，结构色条码填充于多孔阵列后的成像图。

图3  结构色条码表面固相RPA的条件优化与检测性能评估。a，探针修饰时间与荧光强度的关系；b，BSA封闭时间与条码表面BSA-FITC荧光强度的关系，用于表征封闭效果；c，间隔T碱基数目（0、15、30、45）与荧光强度的关系；d，exo probe浓度与荧光强度的关系；e，最优条件下条码在固相RPA扩增前后荧光强度对比；f，荧光强度与DNA浓度的定量关系，检测下限为0.1 nM，线性检测范围为0.1至100 nM。

图4  超亲水多孔阵列上铜绿假单胞菌DNA的dRPA数字检测与绝对定量分析。a，不同稀释浓度铜绿假单胞菌DNA在多孔阵列中的dRPA检测结果，用于区分阳性孔与阴性孔，并结合泊松统计进行模板拷贝数判定；b，实验测得浓度与已知浓度的线性拟合结果，二者一致性良好，R2=0.9973，说明该平台具有较好的绝对定量可靠性。

图5  结构色条码对三种尿路感染相关细菌的多重识别及荧光统计分析。a，负载exo probe的三种结构色条码在加入不同靶标后进行固相RPA的明场与荧光成像，分别对应铜绿假单胞菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌；b，三种条码与不同靶标反应后的荧光统计结果，用于表征各条码的响应强度与检测选择性。

综上，本研究的核心创新在于提出“数字扩增+结构色编码”的一体化设计，将超亲水多孔阵列、dRPA与结构色条码集成于同一平台，证明其兼具核酸绝对定量与多重识别能力，具有较好的方法学价值与转化潜力。但该体系仍处于概念验证阶段，当前动态范围主要为1-100 copies/μL，高浓度样本需预稀释，且条码制备复杂、亲水改性持久性有限，仍制约实际应用。未来应进一步简化制备流程，提升表面稳定性，扩展检测范围，并推动其向耐药基因检测、微流控自动化和便携式读出方向发展。

原文链接：https://doi.org/10.1021/acs.analchem.5c07570