DNA分子电路因其前所未有的可编程性，已成为设计复杂、精确生物分子工具的强大平台。在生物传感领域，各种等温、无酶DNA扩增电路（如催化发夹组装CHA、杂交链式反应HCR）因其操作简单、成本低廉而被广泛用于痕量生物分子检测。然而，这些电路主要作为信号放大策略，其灵敏度受限于循环次数的多少，通常仅提供线性或二次方的信号放大。

相比之下，作为分子生物学革命性技术的聚合酶链式反应，通过聚合酶不断驱动新靶标复制物的形成，实现了靶标序列的指数级扩增，从而获得了极高的检测灵敏度。当前的无酶核酸扩增技术虽然提供了简便性和信号放大，但缺乏PCR这种关键的靶标扩增能力，而后者对于实现超灵敏检测至关重要。因此，设计和编程一种能够模拟PCR循环、实现靶标DNA序列指数复制和信号放大的无酶DNA电路，是一项既具挑战性又意义重大的工作。

这样的电路将PCR的指数复制能力与等温、无酶操作的简便性结合起来，标志着在连接酶促与非酶促信号放大方法方面取得了突破。更重要的是，这种创新电路通过编程DNA分子实现了定制的、类PCR的复制功能，可为开发定制化DNA电路提供有价值的模型。

研究内容

图1.SAA电路的工作原理

该电路仅由三个DNA反应物组成：底物DNA、发夹1和发夹2。它们被精心编程，分别执行靶标序列的识别、复制和循环三个步骤，精确模拟了PCR循环中的退火、延伸和变性。当目标DNA存在时，会触发电路启动。在一个基本循环中：目标DNA先识别并打开S，形成中间复合物；随后H1被打开，释放出被其封闭的完整靶标复制序列；最后，H2与复合物反应，置换并循环出原始靶标DNA，形成最终的三链复合物产物，并释放出一个全新的、完整的靶标复制序列。与PCR中新生成的DNA链可作为下一循环的模板类似，新释放的靶标复制物和循环出的原始靶标都能启动后续循环，从而实现靶标的指数复制和荧光信号的指数放大。

图2.PCR样SAA电路的性能验证

监测不同初始靶标浓度下的产物生成曲线，观察到了典型的S型动力学曲线，这是类PCR、自催化系统的特征。以100 pM靶标为例，反应速率随时间变化清晰地显示了S型曲线的不同阶段：缓慢诱导期、快速指数放大期、线性增长期和最终饱和期。这与PCR的反应动力学特征一致。实验结果证实了该PCR样、自催化系统的成功构建。

图3.SAA的潜在机制探索

当仅使用S和H1时，会进行传统的HCR，最终生成长的双链DNA聚合物。而引入H2后，会启动完整的三步SAA循环，最终产物是小的三链复合物，而非长聚合物。通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和荧光实验验证了这一假设。PAGE结果显示，靶标激活的HCR系统产生了高分子量产物条带，而SAA系统则产生了一条与预退火S·H1·H2迁移率相同的约150 bp的新条带，证实了产物差异。

图4.SAA电路用于DNA检测的性能评估

荧光光谱显示，荧光强度随靶标DNA浓度增加而增强。在10 pM至10 nM浓度范围内，荧光变化与靶标浓度的对数呈线性关系，检测限为8.9 pM。相比之下，非自催化的HCR系统的检测限为0.9 nM，比SAA系统高了约100倍。这种灵敏度的显著提升归因于SAA系统的自催化反馈通路。

图5.用于miRNA-21检测的Hp转导SAA电路性能评估

该系统可直接检测miR-21，无需逆转录步骤。实验表明，荧光信号随miR-21浓度增加而增强，在10 pM至10 nM范围内线性良好，检测限为9.2 pM。与许多其他miRNA检测方法相比，该方法耗时更短、使用的DNA反应物更少。在稀释人血清中的测试表明，血清对扩增过程影响极小，系统稳定性高。加标回收实验获得了98.1%至105.9%的高回收率。初步临床验证中，该系统成功检测了十名健康个体和十名卵巢癌患者血清中的miR-21。结果显示，卵巢癌患者的荧光响应显著高于健康个体，与qRT-PCR结果一致，表明该方法有潜力区分卵巢癌患者与健康人。

本研究提出了一种具有创新性无分流设计的、可编程的类PCR非酶自催化DNA电路。通过系统实验，阐明了其内在的类PCR特性和自催化能力。该无酶SAA电路不仅在不引入酶和精确温控的条件下实现了与PCR相同的靶标复制功能，还展现出高自催化效率，减少了还原优化步骤。得益于SAA电路精确的识别和高自催化效率，实现了对靶标DNA的高灵敏、高特异性检测。作为通用信号放大工具，SAA通过转导模块也能检测其他核酸靶标（如miR-21），在血清样本中表现出高灵敏度、选择性和抗干扰能力，并初步成功区分了卵巢癌血清样本。SAA系统独特的等温无酶操作与指数自催化扩增特性相结合，通过其可编程性和现场部署能力，在生物医学分析和临床诊断中具有广阔前景。

原文链接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.analchem.5c01612