Biosensors and Bioelectronics：纸基单酶双底物比色法实现大肠杆菌及 O157:H7 的快速检测与鉴别

大肠杆菌广泛存在于人类和温血动物肠道中，多数菌株属于非致病性共生菌，但某些特殊菌株尤其是产志贺毒素的大肠杆菌，可引发严重健康风险。其中，大肠杆菌 O157:H7 是最受关注的致病型之一，感染后可导致腹部痉挛、腹泻、出血性结肠炎，严重时还可能发展为溶血性尿毒综合征。由于这类病原菌通常经受污染食品和水传播，因此，如何在复杂样品中快速、低成本、准确地区分普通大肠杆菌与 O157:H7，一直是食品安全检测和公共卫生防控中的关键问题。

目前常用的培养法、PCR 和 ELISA 等检测手段虽然灵敏度和特异性较高，但整体上存在检测周期长、操作流程繁琐、依赖专业设备和实验条件等问题，限制了其在现场和基层场景中的推广。近年来，电化学、光学、纳米材料和 CRISPR-Cas 等新型传感技术不断发展，在提高检测灵敏度和选择性方面取得了明显进展，但其成本、仪器复杂度、生物识别元件稳定性以及批量化应用难度，依旧制约了其广泛落地。相比之下，纸基分析装置因成本低、便携、样品消耗少、可实现可视化读数且适合资源有限场景，被认为是快速检测食源性病原菌的重要技术方向。

本研究正是在这一背景下展开，研究重点不是单纯提升检测灵敏度，而是希望利用纸基平台建立一个既能快速检测、又能对两种大肠杆菌菌株进行区分的新体系。研究者注意到，普通大肠杆菌与 O157:H7 都具有 β-半乳糖苷酶活性，但两者对不同底物的响应存在差异，因此有望借助同一酶、不同底物之间的显色偏好，构建简洁而有效的鉴别系统。基于这一思路，本研究选择了两种 β-半乳糖苷酶特异性显色底物 X-gal 和 CPRG，并将其引入同一纸基检测平台中，通过单底物筛选、动力学分析、双底物配比优化、比值计算、食品加标实验和机器学习评价，最终形成了一套兼具可视化判读和定量分析能力的检测方法。

如图1所示，本研究首先给出了所开发纸基检测体系的整体设计思路和工作原理。图中展示了双底物体系下普通大肠杆菌与 O157:H7 的不同显色路径，以及单菌和双菌条件下的综合色差异。该设计的核心在于利用菌株间酶-底物亲和力的差别，将显色信号直接转化为菌株区分结果，从而避免额外复杂的识别元件和多步判读过程。这种策略在本研究中构成了整个检测方案的逻辑基础。

图1. 所开发测定的示意图 (a) 用于区分大肠杆菌和大肠杆菌 O157:H7 的纸基比色平台 (b) 每种菌株对单独显色底物、X-gal 和 CPRG 的响应 (c) 两种细菌在组合双底物条件下的比色响应。

在单底物实验中，本研究首先分别考察了 X-gal 与 CPRG 对两种菌株的反应特征。结果显示，普通大肠杆菌在 X-gal 条件下具有更快的显色速度，而 O157:H7 在 CPRG 条件下则更容易形成明显颜色信号。换句话说，普通大肠杆菌更偏向于“X-gal 路径”，而 O157:H7 更偏向于“CPRG 路径”。研究者先在商业 96 孔板中完成单底物条件优化，再将同样的体系迁移到纸基 96 孔平台中，结果证明纸基平台仍然能够较好复现这种菌株依赖的显色差异。

如图2所示，本研究系统比较了在商业 96 孔板和纸基 96 孔板中，两种菌株在单底物条件下的吸光度变化和显色表现。图2a至图2d主要反映商业 96 孔板中的显色与吸光度趋势，图2e至图2h则展示了纸基 96 孔板中的对应结果。可以看出，无论是普通大肠杆菌还是 O157:H7，在两个平台中都保持了相似的底物偏好趋势。也就是说，纸基平台并没有改变菌株与底物之间的本征反应关系，而是较稳定地保留了其差异化响应特征。这一点对于后续把实验室优化结果迁移到便携式纸基设备上至关重要。

图2. 单底物检测中不同平台上两种菌株的吸光度变化及对应显色图像：（a）商业 96 孔板中 CPRG 对大肠杆菌和大肠杆菌 O157:H7 的响应；（b）商业 96 孔板中 X-gal 对大肠杆菌和大肠杆菌 O157:H7 的响应；（c）商业 96 孔板中大肠杆菌在 X-gal 和 CPRG 条件下的响应；（d）商业 96 孔板中大肠杆菌 O157:H7 在 X-gal 和 CPRG 条件下的响应；（e）纸基 96 孔板中 CPRG 对大肠杆菌和大肠杆菌 O157:H7 的响应；（f）纸基 96 孔板中 X-gal 对大肠杆菌和大肠杆菌 O157:H7 的响应；（g）纸基 96 孔板中大肠杆菌在 X-gal 和 CPRG 条件下的响应；（h）纸基 96 孔板中大肠杆菌 O157:H7 在 X-gal 和 CPRG 条件下的响应。

为了更深入理解这种单底物差异，本研究进一步开展了动力学分析，并利用 Lineweaver-Burk 线性化方法求得两种菌株与两种底物之间的表观 Km 值和反应特征。结果表明，在 X-gal 体系中，普通大肠杆菌的 Km 为 5.36 mM，而 O157:H7 的 Km 为 9.83 mM；在 CPRG 体系中，O157:H7 的 Km 为 0.561 mM，而普通大肠杆菌的 Km 为 2.73 mM。由于较低的 Km 往往意味着更高的底物亲和力，因此这些结果清楚地说明：普通大肠杆菌对 X-gal 更敏感，而 O157:H7 对 CPRG 更敏感。

如图3所示，本研究展示了两种菌株在 X-gal 和 CPRG 条件下的时间依赖吸光度变化以及相应的动力学拟合结果。图3a至图3d对应 X-gal 体系，图3e至图3h对应 CPRG 体系。图中不仅显示出不同底物浓度下信号增长速率的差异，也进一步支持了前述底物偏好结论。通过这一部分内容，论文把单底物结果与机制分析完整连接起来，为后续设计双底物检测体系提供了坚实依据。

图3. 两种菌株与不同底物的 Michaelis-Menten 动力学分析。（a）大肠杆菌在不同 X-gal 浓度下的时间依赖吸光度变化；（b）对应的 Lineweaver-Burk 拟合图；（c）大肠杆菌 O157:H7 在不同 X-gal 浓度下的时间依赖吸光度变化；（d）对应的 Lineweaver-Burk 拟合图；（e）大肠杆菌在不同 CPRG 浓度下的时间依赖吸光度变化；（f）对应的 Lineweaver-Burk 拟合图；（g）大肠杆菌 O157:H7 在不同 CPRG 浓度下的时间依赖吸光度变化；（h）对应的 Lineweaver-Burk 拟合图。

在单底物差异和动力学规律明确之后，本研究进入了双底物体系的构建阶段。研究者比较了多种 X-gal 和 CPRG 的浓度组合，包括 5 mg/mL X-gal 配 1.25 mg/mL CPRG、10 mg/mL X-gal 配 1 mg/mL CPRG、15 mg/mL X-gal 配 0.75 mg/mL CPRG 和 20 mg/mL X-gal 配 0.5 mg/mL CPRG 等。实验结果表明，在 X-gal 浓度较低、CPRG 浓度较高时，CPRG 的红色信号会在综合色中占据主导，从而掩盖 X-gal 所体现出的普通大肠杆菌特征；而当 X-gal 提高、CPRG 降低后，两种菌株间的综合色差异才开始变得明显。

最终，本研究确定 20 mg/mL X-gal 与 0.5 mg/mL CPRG 是最优双底物组合。在这一条件下，普通大肠杆菌可以稳定呈现绿色，而 O157:H7 则呈现洋红色，且颜色差异在 20 min 内最为清晰。研究还强调，这一组合不仅实现了肉眼识别，也为吸光度比值分析提供了最有利的参数空间。对于一个面向现场的快速检测体系而言，这一点非常重要，因为它使方法兼顾了“看得见”和“算得准”两种优势。

如图4所示，本研究对双底物体系进行了比值分析与可视化效果比较。图4a和图4b分别给出了 650/574 和 574/650 两个比值在不同平台和不同菌株间的差异，图4c和图4d则直接展示了商业 96 孔板和纸基 96 孔板上的综合色结果。研究指出，650/574 比值与 X-gal 所主导的蓝色产物相关，因此在普通大肠杆菌中更高；574/650 比值与 CPRG 所形成的红色产物相关，因此在 O157:H7 中更高。这意味着，通过比值而非单一波长吸光度进行判别，可以更稳健地对两类菌株进行区分。

图4. 双底物检测体系的比值分析与显色比较：（a）两种平台上大肠杆菌与大肠杆菌 O157:H7 的 650/574 吸光度比值比较；（b）两种平台上大肠杆菌 O157:H7 与大肠杆菌的 574/650 吸光度比值比较；（c）商业 96 孔板中两种菌株的颜色差异比较；（d）纸基 96 孔板中两种菌株的颜色差异比较。

本研究还考察了双底物体系中的反应效率损失问题。由于 X-gal 和 CPRG 同时竞争同一酶活性位点，因此双底物体系在提升区分能力的同时，也不可避免地会造成底物之间的竞争，从而降低单一底物条件下的反应效率。研究计算表明，对于普通大肠杆菌，X-gal 和 CPRG 的平均效率损失分别为 47.15% 和 32.85%；对于 O157:H7，则分别为 53.34% 和 28.46%。总体上看，X-gal 的效率损失普遍高于 CPRG，而 O157:H7 与 CPRG 之间的效率损失最低，这进一步印证了 O157:H7 对 CPRG 具有更高亲和力的结论。尽管存在效率损失，双底物体系依然保持了优良的区分表现，因此这一折中被认为是可接受的。

在完成纯菌体系验证后，本研究进一步将该方法应用于加标肉样，以评价其在真实食品基质中的检测适用性。实验结果表明，在加标肉样中，两种菌株经过 2 h 富集后即可观察到较弱但可辨识的初始显色；随着富集时间延长，颜色逐渐加深，在 4−8 h 范围内形成更清晰的区分效果。普通大肠杆菌依旧表现为绿色，而 O157:H7 依旧表现为洋红色，说明双底物体系在复杂食品基质中仍然保留了稳定的菌株特异性信号。

如图5所示，本研究给出了食品加标实验、交叉反应、重复性及绿色评价的综合结果。图5a和图5b分别展示了普通大肠杆菌和 O157:H7 在肉样中的加标检测表现，包括时间依赖的颜色变化和吸光度分析；图5c则展示了与多种非目标菌株的交叉反应结果；图5d给出了重复性分析；图5e和图5f则是绿色评价结果。通过这些数据，论文不仅证明该方法“能测到”，也证明其“测得准、测得稳、测得省”。

图5.（a）大肠杆菌肉样加标检测结果：包括（i）肉样显色照片和（ii）不同菌浓度条件下的吸光度分析；（b）大肠杆菌 O157:H7 肉样加标检测结果：包括（i）肉样显色照片和（ii）不同菌浓度条件下的吸光度分析；（c）利用 X-gal 和 CPRG 对大肠杆菌和大肠杆菌 O157:H7 以及多种非目标菌株进行交叉反应评价；（d）在 10^8 CFU/mL 条件下进行的重复性分析，显示两种菌株四类吸光度比值（R1−R4）的重复测定结果；（e）商业 96 孔板检测体系的 AGREE 绿色评价结果；（f）纸基 96 孔板检测体系的 AGREE 绿色评价结果。

在加标食品样品中，本研究将“纯菌检出限”和“富集后检出限”进行了明确区分。对于纯菌样品，该方法在 30 min 内的检出限为 10^3 CFU/mL，而在 20 min 内能够有效区分两种菌株的最低浓度约为 10^6 CFU/mL。对于富集后的食品样品，检测灵敏度显著提高，检出限可达到 10 CFU/mL。换句话说，该方法一方面能够在纯菌条件下实现快速筛查，另一方面也能够通过短时富集满足复杂食品样品中的更高灵敏度需求，这一点使其在实际食品安全监测中更具现实意义。

针对选择性问题，本研究还开展了非目标菌株交叉反应评价。结果显示，对于普通大肠杆菌，650/574 比值明显高于 O157:H7；对于 O157:H7，574/650 比值又显著高于普通大肠杆菌。所有测试的非目标菌株，其两个比值均低于设定的 0.25 截止值。论文认为，虽然某些非目标菌也可能具有一定 β-半乳糖苷酶活性，但其酶水平不足以在设定时间窗内产生可混淆信号。再结合实际样品处理中所使用的 E. coli 选择性富集培养基，可以进一步降低假阳性风险。

在重复性方面，本研究使用 10^8 CFU/mL 的纯菌样本进行了 10 次独立实验，结果表明无论是普通大肠杆菌还是 O157:H7，相关吸光度比值均表现出较低相对标准偏差，证明该方法具有较好的实验可重复性。对一个面向现场应用的纸基检测体系而言，这一点非常关键，因为如果结果受操作者或批次影响太大，即使原理再新颖，也难以真正落地。

除显色分析外，本研究还将机器学习引入变量重要性分析与分类性能评价，希望进一步判断哪些检测特征最有助于菌株区分。研究选择了六类吸光度相关特征，包括单底物条件下的 650 nm 和 574 nm 吸光度、双底物条件下的 650 nm 和 574 nm 吸光度，以及 650/574 和 574/650 两个比值，并采用随机森林、极端梯度提升、支持向量机和神经网络模型进行比较。结果显示，随机森林和极端梯度提升模型都将吸光度比值视为最关键特征，而支持向量机和神经网络则更依赖某些绝对吸光度值。总体而言，吸光度比值仍是最稳定、最具判别能力的核心参数。

主成分分析进一步证明了这一点。两种菌株在主成分空间中可以形成较为清晰的聚类分离，而对这种分离贡献最大的同样是比值特征。虽然由于两类菌株在遗传背景和代谢特征上具有一定相似性，聚类边界并非绝对分离，但整体趋势已经足以说明：在该纸基双底物体系中，比值分析是最可靠的判别策略。进一步的模型性能评估显示，随机森林的总体分类表现最优，既具备较高准确率，也能较平衡地区分阳性和阴性样本。

如图6所示，本研究给出了主成分分析和机器学习模型性能评价结果。图6a显示两种菌株在 PCA 得分图中的分布，图6b展示各吸光度参数在分类中的贡献方向，图6c则总结了不同 AI 模型在准确率、精确率、召回率和 F1 值上的比较。这一组结果说明，本研究提出的双底物纸基检测体系不仅能做“可视化区分”，还能够在数据分析层面支撑更加稳健的菌株分类。

图6.（a）主成分分析得分图，显示大肠杆菌与大肠杆菌 O157:H7 的聚类分布；（b）主成分分析载荷图，显示不同吸光度参数对菌株区分的贡献；（c）多种人工智能算法对样品分类性能的比较，包括准确率、精确率、召回率和 F1 值等指标。

本研究还特别强调了纸基平台在绿色分析化学方面的优势。相比传统 96 孔板检测通常需要更大量的样品、试剂和塑料耗材，纸基平台显著降低了细菌样液、裂解液和底物的使用量，并通过可降解纸基材料减少塑料废弃物。基于 AGREE 指标的绿色评价显示，纸基体系的得分达到 0.86，而传统 96 孔板体系为 0.80。这意味着，该方法不仅在检测速度和成本上具有优势，也更符合当前绿色分析和可持续发展导向。

此外，本研究还测试了预包被试剂纸基检测板的储存稳定性。结果表明，在室温条件下，预包被有醋酸锂、X-gal 和 CPRG 的纸基板在 30 d 内仍可维持较好检测性能，虽然随时间推移信号略有下降，但整体上仍能保持可接受的显色与区分效果。研究认为，这种轻微下降可能与 X-gal 的逐渐水解和氧化、CPRG 的部分降解、醋酸锂吸湿以及试剂在纸基多孔结构中的缓慢扩散有关。即便如此，该体系依然展现出良好的储存潜力，这为未来开发预制型纸基检测试剂盒提供了支持。

综上所述，本研究提出的纸基单酶双底物比色检测策略，通过利用普通大肠杆菌与 O157:H7 对 X-gal 和 CPRG 的差异性响应，建立了一套能够同时实现快速检测和菌株区分的便携式分析平台。该方法在 20 min 内即可通过综合色实现菌株初步鉴别，并通过 650/574 和 574/650 比值实现更稳健的定量判定；在纯菌样品中检出限可达 10^3 CFU/mL，在富集食品样品中可提升至 10 CFU/mL；同时还兼具试剂消耗低、废弃物少、重复性较好和绿色评价较优等优势。本研究表明，这一纸基双底物比色体系不仅为食源性致病菌快速筛查提供了新思路，也为今后将机器学习进一步融入现场病原检测平台奠定了基础。

论文来源：https://doi.org/10.1016/j.bios.2026.118633