非接触式高光谱成像：高效识别混合生物膜中的机会性病原体

生物膜是由细菌和真菌细胞嵌入其自身分泌的胞外基质中形成的多细胞聚集体，广泛分布于医院设备、食品加工表面及供水管道等多种环境中。生物膜不仅难以彻底清除，还能有效庇护其内部潜伏的机会性病原体，使其更难受到抗菌药物或消毒措施的影响，成为医院感染和食品安全领域的主要威胁之一。在实际污染环境中，微生物很少以单一物种形式存在，通常通过形成复杂的混合群落以适应环境。另外，在医院相关生物膜形成菌中，ESKAPEE类病原体受到高度关注。因而，本研究以金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌和白念珠菌为主要研究对象，探索非接触式高光谱成像识别混合生物膜中机会性病原体的可行性。如图1所示，不同微生物形成的生物膜结构差异明显。单独培养时，金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和肺炎克雷伯菌的生物膜结构相对疏松；而当金黄色葡萄球菌与大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌或粪肠球菌共同培养时，生物膜整体更为致密，细胞间连接更加紧密，胞外基质也更加丰富。相比之下，细菌与白念珠菌共同形成的生物膜结构相对松散，刚性较低，这可能与白念珠菌在该实验条件下未形成明显菌丝结构、从而限制细菌黏附能力有关。上述结果说明，混合生物膜并不是单一微生物生物膜的简单叠加，微生物之间的相互作用会改变生物膜的空间结构、表面形态和基质分布，也使其识别与清除更加复杂。因此，仅依靠传统采样检测往往难以及时反映表面污染状态，亟需一种能够快速、非接触识别复杂混合生物膜的检测方法。

图1  48小时单物种与双物种生物膜的扫描电镜形貌(SEM,24000×放大)。

为验证高光谱成像是否能够捕获混合生物膜中的病原体识别信息，研究团队进一步分析了370个样本的平均反射光谱与微生物组成之间的关系。如图2所示，Spearman相关分析首先显示，不同光谱波段与特定微生物的存在之间存在一定相关性；随后，偏相关分析在排除其他变量干扰后，进一步筛选出与微生物组成独立相关的关键波段。基于这些具有统计学意义的偏相关关系，研究团队重建了贝叶斯网络，用于描述反射光谱特征与不同病原体之间的关联结构。结果表明，高光谱反射信号并非只反映生物膜表面颜色或亮度变化，而是包含与微生物种类相关的有效信息，说明利用高光谱成像识别混合生物膜中的机会性病原体具有可行性。

图2  生物膜反射光谱与微生物组成的相关性及贝叶斯网络分析。

结果1：高光谱成像显著优于常规生化组成和表面粗糙度分析方法

研究系统对比了常规生化组成分析、表面粗糙度分析、平均光谱分析和完整3D高光谱成像分析的识别效果，评价指标主要为AUC：

生化成分分析：AUC约为0.55至0.80

生化成分＋表面粗糙度分析：AUC约为0.60至0.88

平均光谱分析：AUC通常高于0.80，金黄色葡萄球菌可接近0.98

完整3D HSI＋CNN分析：AUC通常约为0.90或更高，金黄色葡萄球菌可达约0.998

这表明，HSI能够捕获超越常规生化成分和表面粗糙度特征的额外互补信息。同时，完整3D HSI结合CNN的表现优于仅使用平均光谱的分析方法，提示空间纹理和结构信息对识别混合生物膜中的目标微生物具有重要贡献。

图3  四种方法对混合生物膜中六种病原体的识别效果AUC值对比。

结果2：结构信息比扩展光谱波段更重要

在实际应用中，覆盖SWIR波段的相机成本较高。研究发现：对于平均光谱分析，去除SWIR和NIR后，识别效果明显下降，AUC通常下降0.05至0.10。但对于3D HSI分析，即使仅使用可见光波段，多数情况下CNN模型仍能获得与加入NIR或SWIR波段相近的AUC，个别菌种甚至略有提升，仅部分情况下出现轻微下降。

这一结果说明，在完整3D HSI分析中，空间纹理和结构信息对识别效果具有重要贡献，并且在一定程度上可弥补扩展光谱波段减少带来的信息损失。

图4  不同光谱波段下混合生物膜中机会性病原体的识别效果。图中比较了平均光谱分析和完整3D高光谱成像结合CNN分析在可见光、可见光＋近红外、可见光＋近红外＋短波红外波段下的AUC表现。结果显示，平均光谱分析更依赖扩展光谱波段，而完整3D高光谱成像在仅使用可见光时仍能保持较高识别性能，提示空间纹理与结构信息对病原体识别具有重要贡献。

结果3：在更复杂的双物种生物膜模型中保持较好识别性能

在由临床分离株随机配对形成的双物种生物膜中，模型依然表现较好。完整3D HSI分析对多数目标微生物的AUC通常保持在0.90至0.95之间；其中金黄色葡萄球菌由于具有较为特征性的反射光谱模式，AUC可达到约0.995。需要注意的是，这一场景虽然比单物种模型更复杂，也更接近实际混合污染状态，但仍属于体外构建并经固定处理后的模型生物膜体系，不能直接等同于真实医院、食品或人体组织表面的现场样本。

图5  不同生物膜复杂度下机会性病原体的识别效果。图中比较了平均光谱分析与完整3D高光谱成像分析在四类样本中的AUC表现，包括单轮实验单物种生物膜、三轮实验单物种生物膜、ATCC菌株与临床分离株形成的双物种生物膜，以及临床分离株随机配对形成的双物种生物膜。结果显示，随着样本复杂度和种内差异增加，识别效果有所下降，但完整3D高光谱成像仍保持较高AUC，表现出更好的鲁棒性。

综上，本研究证明，高光谱成像结合机器学习可用于体外模型生物膜中多种机会性病原体的非接触式识别。其核心突破在于，研究不仅分析了平均反射光谱，还进一步利用完整3D高光谱立方体中的空间纹理和结构信息，从而提高了复杂混合生物膜中的病原体识别能力。

对于单物种生物膜，模型识别准确率可达到95%至99.5%；对于更常见的混合生物膜，革兰阴性菌的识别准确率约为90%至92%，真菌和革兰阳性菌的识别准确率约为96%至99%。这些结果均是在体外实验条件下获得的。

这是少数将HSI用于混合生物膜中多种病原体识别的成功研究之一，并且是首次成功应用于混合细菌-真菌生物膜识别的研究之一。需要强调的是，这项研究仍然是概念验证性质的体外研究，样本为在聚苯乙烯板上形成并经戊二醛固定后的模型生物膜。该方法距离真实环境中的直接检测仍有若干问题需要解决，包括最低可检测生物量、未固定原生生物膜的光谱特征、湿润和非静态表面的成像稳定性、人体组织或金属等复杂表面的适应性，以及内窥镜或管道等受限空间中的实时成像问题。

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.aca.2026.345098