ACS Sensors：μSTRAW微流控装置结合便携式LAMP实现大肠杆菌现场核酸检测

大肠杆菌检测在环境监测、动物健康和人类疾病防控中都具有重要意义。在环境领域，大肠杆菌常被视为水质污染的重要指示菌；在临床领域，致病性大肠杆菌与尿路感染、败血症等疾病密切相关。因此，无论是针对洗浴水、废水，还是针对尿液和血液样本，建立快速、可现场实施的检测方法都具有现实价值。相比传统培养法通常需要 24−48 h 才能获得结果，便携、快速并具备较低检测下限的分子检测体系，显然更适合及时预警和早期干预。

尽管核酸检测本身具有特异性高、目标范围广等优点，但真正走向现场应用时，最常见的限制并不在扩增或读出环节，而在样品前处理尤其是 DNA 提取步骤。对于血液、尿液等复杂样品来说，体系中存在大量可抑制扩增的杂质分子，如果没有有效的纯化步骤，后续扩增结果往往不稳定。传统实验室提取流程通常依赖离心机等大型设备，同时需要多步手工操作和熟练人员参与，这些因素共同限制了核酸检测在基层、流动和资源受限场景中的应用。因此，如何开发出一种体积更小、操作更简便、又能兼容多样本并行处理的便携式 DNA 提取方案，成为现场核酸检测落地的关键瓶颈。

本研究提出的 μSTRAW 正是围绕这一瓶颈展开。研究者开发出一种紧凑型、重力驱动的微流控 DNA 提取装置，并将其直接与商用便携式 Genie Lite LAMP 仪器耦合，构建出一套面向现场检测的完整核酸分析流程。其设计核心在于利用小口径微毛细管和磁珠法 DNA 纯化，在不依赖复杂泵阀和大型仪器的条件下，实现细胞裂解后 DNA 的捕获、清洗、洗脱和扩增检测衔接。论文指出，这一系统的目标并不仅是“做小”，而是在缩小尺寸的同时，尽量不牺牲传统实验室方法的检测能力，并进一步提高试剂利用效率和多样本并行处理能力。

如图1a所示，μSTRAW 与便携式 LAMP 组合后的总体流程包括细胞裂解、DNA 在磁珠上的结合、磁珠在微毛细管中的捕获与清洗、DNA 洗脱以及进入 Genie 仪器的扩增检测。与传统提取流程相比，该装置将多个分散的实验步骤集成到了一个可手持、可并行操作的小型平台之中。如图1b和图1c所示，研究者还设计了一个 3D 打印支架，可同时容纳 8 个 μSTRAW，从而支持 8 份样本同步处理；如图1d至图1f所示，磁珠在微毛细管中的捕获状态和外部磁体定位方式也得到了清楚展示，这说明装置不仅仅停留在原理层面，而是已经形成了可操作、可放大的实物构型。

图1.（a）使用 μSTRAW 与 Genie 便携式 LAMP 仪进行 DNA 检测的工作流程。细胞裂解后，结合 DNA 的磁珠在小口径微毛细管中被捕获并清洗，以去除蛋白质、盐等污染物，随后进行 DNA 洗脱并进入 LAMP 检测。（b）可同时固定 8 个 μSTRAW 的 3D 打印支架正视图显微照片。（c）可同时固定 8 个 μSTRAW 的 3D 打印支架侧视图显微照片。（d）捕获磁珠后的 μSTRAW 后视图，可见沿微毛细管长度方向分布的暗色条带。（e）带磁体组件的 μSTRAW 后视图，蓝色外壳和黑色盖板用于固定磁体以捕获磁珠。（f）带磁体组件的 μSTRAW 顶视图，支架放置于 96 孔板上，每个 μSTRAW 分别浸入独立微孔中。

从原理上看，μSTRAW 延续了重力驱动微流控虹吸结构的思路，但进一步朝着小型化和实用化方向推进。系统使用涂覆聚乙烯醇的 FEP 微毛细管条带，使原本疏水的内壁转变为亲水，从而让液体先依靠毛细作用完成引发，再借助重力和分子内聚力从“喙端”流向“尾端”。这一点使得装置在不依赖主动驱动模块的情况下，仍可实现样品和试剂的有序输送。研究中所用微毛细管条带由 10 根平行毛细管构成，每根毛细管内径约为 200 μm，这一结构既有利于液体传输，也为外部磁体对磁珠的高效控制提供了空间基础。

如图2所示，本研究详细展示了 μSTRAW 的 DNA 提取流程。整个过程首先通过引发液启动液体流动，随后将“喙端”浸入含有磁珠-DNA 复合物的样品中，“尾端”放入预加洗液的微孔中，在外部磁场作用下，磁珠沿流路移动并被截留在毛细管内。之后再进行两轮清洗，以去除蛋白质、盐和其他潜在抑制物；随后加入洗脱液释放 DNA；最后将洗脱得到的 DNA 导入 LAMP 体系或先收集到洗脱液中再转入扩增反应。这一流程的意义在于，它用一种被动、紧凑的流体结构，替代了传统实验室中依赖离心、弃液和反复转移的繁琐步骤。

图2. 使用 μSTRAW 进行 DNA 提取的操作流程。（步骤1）先用引发液启动 μSTRAW 内的毛细流动，为后续依靠重力和分子内聚力的液体传输做准备。（步骤2）将 μSTRAW 的“喙端”浸入含有磁珠-DNA 的样品中，“尾端”置于装有 20.00 μL 洗液的废液孔中，在外部磁体作用下，磁珠被带入并截留在微毛细管中。（步骤3 和步骤4）进行两轮清洗，使洗液流经微毛细管，以去除杂质。（步骤5）加入洗脱液，并在无磁体条件下孵育 10 min，以削弱磁珠聚集并促进 DNA 释放。（步骤6）重新放置磁体后，将“喙端”浸入洗脱液，“尾端”浸入 24.75 μL LAMP 反应液或 20.00 μL 洗脱液中，随后将含 DNA 的 LAMP 反应体系转入光学反应管，在 Genie 仪器上完成检测；或者先将 DNA 收集至洗脱液中，再取 9.00 μL 加入含 16.00 μL LAMP 反应液的光学管中进行分析。

为了提升 DNA 回收效率并避免流动堵塞，本研究对 μSTRAW 的长度和磁珠浓度进行了系统优化。研究比较了 49 mm、60 mm、45 mm 和 25 mm 四种长度设计，并同时考察了磁珠稀释比例和磁体配置。结果表明，45 mm 长的 μSTRAW 在检测成功率、流动稳定性和 DNA 回收效率之间实现了较好平衡。研究指出，过长的微毛细管虽然可以提升样品通量，但会增加洗脱体积，从而稀释回收 DNA；而过短的结构则可能导致磁珠在洗脱阶段更容易流失，进而影响扩增结果。换言之，装置尺寸并非越短越好，而是需要在流体稳定性、磁珠截留和洗脱回收之间取得折中。

如图3所示，49 mm、60 mm 和 45 mm 三种 μSTRAW 设计在 LAMP 扩增成功率上存在明显差异。研究使用“30 min 内是否扩增成功”作为比较指标，结果显示 45 mm 设计总体表现更稳。60 mm 设计虽然可处理更大流量，但由于洗脱后只有部分 DNA 真正被导入扩增体系，因此存在回收损失；而 25 mm 设计则因为磁珠距离出口过近，更容易在无磁孵育阶段或液流作用下流失，导致扩增表现不如 45 mm。通过这一步优化，本研究为后续所有性能测试锁定了最适合的结构参数。

图3. 不同长度 μSTRAW 设计的比较：（a）49 mm 长 μSTRAW 的 LAMP 扩增结果；（b）60 mm 长 μSTRAW（配可移动磁体）的 LAMP 扩增结果；（c）45 mm 长 μSTRAW 的 LAMP 扩增结果。柱状图显示各设计中“扩增成功”和“未扩增”样本所占比例。

 在磁珠使用方面，本研究进一步发现，将商业磁珠试剂按 1:4 稀释后使用，可在保持较好 DNA 结合能力的同时减少流动阻力，改善整体操作表现。研究说明，磁珠过多会降低流速、延长清洗步骤并增加堵塞风险；但如果磁珠过度稀释，又会降低 DNA 结合容量。因此，本研究通过延长捕获时间和优化微流控流路，尽可能弥补稀释带来的潜在影响。综合比较后，45 mm μSTRAW 配合 1:4 稀释磁珠被确定为后续实验的主方案。这一点也说明，该系统的表现不仅取决于结构本身，还取决于磁珠量、样品体积和洗脱条件之间的匹配关系。

在完成装置优化后，本研究首先在 PBS 中验证了 μSTRAW 的 DNA 提取和核酸检测能力。实验采用 16S RNA 基因引物进行 LAMP 扩增，并比较了两种洗脱策略：一种是先将 DNA 洗脱至缓冲液中，再取固定体积加入 LAMP 反应体系；另一种是直接将 DNA 洗脱至 LAMP 反应液中，以进一步简化步骤并降低稀释效应。结果表明，两种方案在低检出限上大致相近，均可达到 10^3 CFU/mL 量级，但“先洗脱后加样”的方案在结果一致性和标准差控制方面表现更好，非扩增样本更少，整体稳定性也更高。

如图4a和图4b所示，两种 DNA 洗脱策略下的 LAMP 扩增结果可以进行直接对比。研究认为，直接将 DNA 洗脱入 LAMP 反应液虽然能减少一步转移，理论上也有利于提升模板浓度，但实际操作中进入扩增体系的体积更容易波动，从而改变反应体系中各组分浓度，导致结果重复性下降。相反，先将 DNA 收集至独立洗脱液中，再按固定体积加入扩增体系，虽然增加了一步操作，但更有利于控制反应条件，因而更适合作为稳定的现场检测流程。与此同时，论文还给出了与厂家标准协议相比的试剂节省情况，显示 μSTRAW 对蛋白酶K、裂解液、磁珠、结合液和洗液等关键试剂均实现了显著减量。

图4. 使用 16S RNA 基因引物检测 PBS 中大肠杆菌时，两种 DNA 洗脱策略下的 LAMP 结果比较。（a）DNA 先收集于洗脱液中，再加入 LAMP 反应体系；（b）DNA 直接洗脱至 LAMP 反应体系中。图中横向虚线表示阴性对照平均值减去 3 倍标准差；对于 50 min 内无扩增信号的样本，统一按 50 min 计入分析。

 为了进一步提升检测灵敏度，本研究在 PBS 和合成尿液中引入了注射器过滤预浓缩步骤。该步骤完全不依赖大型设备，因而同样适合现场应用：研究者将 60 mL 加标样品装入注射器，通过 0.22 μm 混合纤维素酯滤膜捕获细菌，再用 250 μL PBS 从反方向将细菌洗脱回收，随后进入 μSTRAW 提取和 LAMP 检测流程。这一步的意义在于，在不引入复杂设备的前提下，先把大体积低浓度样品中的目标菌富集到小体积液体中，从而显著提高后续 DNA 提取和扩增检测的有效浓度。

如图5a所示，预浓缩流程包括样品过滤和反向洗脱回收两个核心步骤。研究中还对回收液体积进行了优化，发现较小回收体积更有利于获得更高的最终细菌浓度。结果显示，在 PBS 中，经过注射器过滤后，μSTRAW 的低检出限可提升至 50−100 CFU/mL；而在合成尿液中，尽管阴性对照存在一定背景信号，但 100−1000 CFU/mL 范围内的大肠杆菌样本依然能够和阴性样本明显区分开来。对于尿路感染等实际应用场景，这一检测能力已经具有较强现实意义。研究同时指出，若未来继续扩大过滤体积并优化回收步骤，理论上仍有进一步降低检出限的空间。

图5. 注射器过滤预浓缩后在 PBS 和合成尿液中的大肠杆菌检测结果。（a）注射器过滤预浓缩流程示意图：将 60 mL 含大肠杆菌的 PBS 装入无菌 60 mL 注射器，通过 0.22 μm 混合纤维素酯滤膜过滤，再用 250 μL PBS 从滤膜反向洗脱回收细菌。（b）PBS 中大肠杆菌经注射器过滤后的 DNA 检测结果。（c）合成尿液中大肠杆菌经注射器过滤后的 DNA 检测结果。图中箱线图显示中位数、四分位区间、最大最小值及离群值。

 除 PBS 和合成尿液外，本研究还进一步评估了 μSTRAW 在血液样品中的适用性。血液作为典型复杂基质，不仅含有多种抑制核酸扩增的分子，而且临床样本中的菌量通常很低，因此检测难度更大。为此，本研究采用了先短时富集、后提取检测的策略：将 2 mL 羊血与 8 mL LB 肉汤混合后，在 37 °C 条件下富集 5 h，再从中取出 210 μL 进入 μSTRAW 提取和 LAMP 扩增流程。这一步相当于用较短时间放大了低水平菌血症信号，使得原本难以直接检出的细菌数量进入可测范围。

如图6a所示，血样检测的前处理思路是先进行富集，再进入微流控提取和扩增检测。结果显示，在羊血样品中，经 5 h 富集后，系统可检测到低至 10−23 CFU/mL 的大肠杆菌水平，如图6b所示，这一范围已经进入常见血流感染的实际菌量区间。对于临床应用而言，这一结果非常值得关注，因为它说明 μSTRAW 不仅适用于环境样本，也具备向复杂临床样本延伸的潜力。研究还指出，在实际临床使用中，由于 DNA 提取仅消耗富集体系中的一小部分液体，因此剩余样本仍可用于后续药敏分析或其他病原体检测，这为综合诊断提供了空间。

图6. 羊血样品中大肠杆菌经富集后的检测结果。（a）血样富集流程示意图：将 2 mL 羊血按设定菌浓度加标后，加入 8 mL LB 肉汤，在 37℃ 避光条件下富集 5 h。（b）富集后羊血样品中大肠杆菌的 DNA 检测结果。图中箱线图显示 4 个独立样本的中位数、四分位区间、最大最小值及离群值。

 从整体性能来看，μSTRAW 的一个突出优势在于兼具多样本并行处理和低成本运行能力。研究中构建的支架可同时处理 8 份样品，这一点对于洗浴水、废水和基层筛查等需要较高通量初筛的场景尤其重要。相比许多便携核酸前处理方案一次只能处理单个样本，μSTRAW 在规模化应用上更具潜力。与此同时，论文给出的试剂节约结果也很突出：蛋白酶K减少 65%，裂解液减少 83%，磁珠减少 91%，这意味着单位样本检测成本明显下降，更有利于形成可持续、可推广的现场检测方案。

从应用层面看，μSTRAW 的价值并不只在于提出了一个新的微流控结构，更在于它提供了一种更接近真实部署的便携核酸检测路径。首先，它直接对接已有的便携式 LAMP 仪器，减少了系统重建成本；其次，它依靠毛细作用与重力实现被动流动，不需要复杂外部动力；再次，它已在 PBS、合成尿液和羊血等多类样本中展示出可行性，并可以结合过滤预浓缩或短时富集进一步提升检测能力。这种“便携前处理 + 便携扩增”的组合方式，使核酸检测真正向实验室外应用迈进了一步。

综上所述，本研究开发的 μSTRAW 微流控 DNA 提取装置，为大肠杆菌现场核酸检测提供了一种兼具便携性、并行处理能力和较高灵敏度的新方案。该系统基于重力驱动的微毛细管结构和磁珠法 DNA 纯化流程，可与便携式 LAMP 仪器直接配合，在 PBS 中实现 1000−5000 CFU/mL 的检测能力，在注射器过滤预浓缩后提升至 50−100 CFU/mL，在合成尿液中达到 100−1000 CFU/mL，在羊血中经 5 h 富集后可低至 10−23 CFU/mL。更重要的是，该方案在试剂用量、成本控制、样本并行处理和跨场景适用性方面都展现出明显优势。本研究表明，μSTRAW 结合便携式 LAMP 有望推动核酸检测进一步走出实验室，在洗浴水、废水、尿液和血液等真实样本中实现更快速、更经济的现场检测。

 论文来源：https://doi.org/10.1021/acssensors.5c04389