Biosensors and Bioelectronics：微孔膜聚合物门控生物传感器实现超灵敏金黄色葡萄球菌检测与快速药敏分析

病原菌快速检测与抗菌药物敏感性测试始终是食品安全、环境监测和感染控制中的关键环节。金黄色葡萄球菌作为常见且危害显著的人体致病菌，既可能存在于食品和环境中，也可能在临床场景中引发严重感染。传统培养法虽然被视为金标准，但检测通常需要 18 至 24 h，且依赖实验室条件和专业人员；PCR、质谱等方法虽然缩短了检测时间，却仍然需要昂贵仪器、复杂前处理和较高技术门槛。对于公共卫生防控而言，真正迫切的需求并不只是“能否检测到细菌”，而是能否以更简单、更低成本、更便携的方式，在尽可能短的时间内完成定量检测，并同时判断细菌对抗生素是否敏感。

围绕这一目标，本研究把刺激响应型聚合物和流动时间读出结合起来，提出了一种微孔膜聚合物门控生物传感器。与依赖复杂交联、包埋或标记步骤的传统聚合物传感体系不同，这一方案直接利用明胶溶液在微孔膜表面累积所形成的“堵膜”效应作为信号来源。系统由针式过滤器中的微孔膜、智能手机和微量注射泵组成，自建的便携负压驱动装置能够自动推动样品沿流道上行，当明胶溶液到达微孔膜后，分子会逐渐堆积并部分阻塞孔道，从而降低流速并延长样品到达检测线所需的时间。

这一设计的关键在于把致病菌生长过程中分泌的生物活性酶转化为可直接读取的流动行为变化。金黄色葡萄球菌能够分泌明胶酶，后者可特异性水解明胶长链分子，使其难以继续在微孔膜表面形成充分堆积，因此微孔阻塞程度下降，流动时间随之明显缩短。也就是说，本研究并非直接测量菌体本身，而是通过检测其生长过程中诱导的明胶水解效应来间接完成定量分析。与此同时，当抗生素抑制金黄色葡萄球菌生长和代谢后，明胶酶产生量会显著下降，微孔膜堵塞程度重新增加，流动时间再次变长，因此同一平台也可以被进一步用于判断细菌对不同药物的敏感性。

图1. 微孔膜聚合物门控生物传感器（MPG biosensor）示意图。（a）MPG 生物传感器的工作原理示意图。（b）利用 MPG 生物传感器开展金黄色葡萄球菌检测与抗菌药物敏感性测试的研究流程示意图。

为了证明这一门控思路确实可行，本研究首先考察了明胶在系统中的基础响应。结果显示，与 PBS 溶液仅需约 10 s 到达检测线相比，5 mg/mL 明胶已将流动时间拉长到 18 s，而且在 0 至 30 mg/mL 范围内流动时间随明胶浓度升高而明显增加，表现出清晰的浓度依赖关系。更重要的是，这一平台对低浓度、低黏度明胶的区分能力优于常规流变测量，说明微孔膜堵塞带来的流动时间变化本身就具有很高灵敏度。

机制分析进一步证明，灵敏读出的根源确实来自明胶在微孔膜表面的累积而非其他偶然因素。扫描电镜结果显示，明胶流经后的膜表面可见孔隙数量明显减少；使用罗丹明 B 标记明胶后，膜的荧光颜色由蓝转紫，且通过膜后的溶液荧光强度显著下降，说明明胶确实被截留并沉积在膜上。进一步去掉微孔膜后，即便测试不同浓度明胶，流动时间也都会迅速降至约 3 s，进一步证实“堵膜”才是信号形成的核心来源。

在系统参数优化方面，本研究系统比较了负压大小、流动距离以及膜材料和孔径对响应性能的影响。随着负压增大，流动时间整体缩短，但以 Flow time25/Flow time0 表示的灵敏度基本保持稳定；在多种 0.22 μm 微孔膜中，Nylon 6 膜同时给出了最长流动时间和最高灵敏度；当 Nylon 6 膜孔径增大时，因对明胶分子的截留能力减弱，灵敏度随之下降。综合检测速度和响应强度后，本研究最终选定约 21 kPa 负压、30 mm 流动距离以及孔径 0.22 μm 的 Nylon 6 膜，且平台在批间重复性和运行稳定性方面均表现良好。

图2. MPG 生物传感器的实验系统与基础响应表征。（a）MPG 生物传感器装置构成示意图。（b）不同浓度明胶溶液的流动时间变化。（c）流经 PBS（I）和 25 mg/mL 明胶溶液（II）后微孔膜的扫描电镜图像。（d）流经 PBS（I）和 25 mg/mL 罗丹明 B 标记明胶溶液（II）后微孔膜的照片。（e）PBS（①）以及 25 mg/mL 罗丹明 B 标记明胶溶液在过膜前（②）和过膜后（③）的荧光光谱。误差棒表示标准差（n = 3）。

在确认门控机制后，本研究先把平台用于明胶酶检测，以验证其对金黄色葡萄球菌关键分泌酶的响应能力。25 mg/mL 明胶溶液本身的流动时间约为 45.5 s，而加入 0.2 mg/mL 明胶酶后迅速降至 12.3 s，已接近 PBS 的 10.5 s。与此对应，明胶液化实验中原本呈胶态的体系在酶作用后转为溶胶态；流变结果也表明加入明胶酶后溶液黏度显著下降，说明长链明胶确实被切割为更低分子量片段。

定量性能方面，本研究将酶-底物孵育时间优化为 30 min，并在 10^-5 至 10^-2 mg/mL 范围内建立了良好的线性关系，线性拟合的 R² 达到 0.992。与此同时，碱性磷酸酶、透明质酸酶、凝血酶、脂肪酶、过氧化氢酶、DNA 酶 I，以及乳酸、乙酸和培养基等潜在干扰物均未显著改变流动时间，说明该平台对明胶酶具有良好的特异性响应。这一结果为后续将其用于金黄色葡萄球菌检测打下了坚实基础。

图3. 利用 MPG 生物传感器检测明胶酶。（a）不同条件下的流动时间，插图为不同实验条件下的明胶液化试验结果。（b）不同变量条件下的稳态剪切黏度。（c）流动时间随孵育时间和明胶酶浓度变化的响应结果。（d）不同明胶酶浓度对应的流动时间。（e）流动时间与明胶酶浓度之间的线性关系。（f）选择性测试。I：明胶酶；II：碱性磷酸酶；III：透明质酸酶；IV：凝血酶；V：脂肪酶；VI：过氧化氢酶；VII：DNA 酶 I；VIII：乳酸；IX：乙酸；X：明胶培养基。误差棒表示标准差（n = 3）。

真正进入病原检测后，本研究观察到金黄色葡萄球菌的引入会显著缩短明胶溶液流动时间，说明细菌分泌的明胶酶能够有效水解明胶。明胶液化实验显示，随着孵育时间延长，体系逐渐由透明转为浑浊并最终完全液化；黏度测试也证明，经金黄色葡萄球菌处理后的明胶溶液黏度远低于明胶空白。通过同时考察孵育时间与菌浓度，本研究发现两者都会显著影响流动时间：在 10^7 CFU/mL 条件下，仅孵育 3 h 就出现了明显时间下降；随着孵育持续，达到同等响应所需的菌浓度不断降低。

最值得关注的是检测灵敏度。本研究指出，在孵育 8 h 后，低至 1 CFU/mL 的金黄色葡萄球菌就足以引起显著流动时间下降，检测限达到 1 CFU/mL。作者还分别在 4、5、6、7 和 8 h 条件下建立了流动时间与菌浓度之间的定量关系，均表现出良好的线性相关性。结合文中对比分析可以看出，这一平台在检测限和线性范围方面都具有明显竞争力，而且选择性同样令人满意：无论是表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌还是大肠杆菌，都没有引起类似强烈的响应，而金黄色葡萄球菌及耐甲氧西林金黄色葡萄球菌则能显著缩短流动时间。

图4. 利用 MPG 生物传感器检测金黄色葡萄球菌。（a）不同条件下的流动时间。（b）不同实验条件下明胶液化试验的照片。（c）不同变量条件下的稳态剪切黏度。（d）流动时间随孵育时间和金黄色葡萄球菌浓度变化的响应结果。（e）不同孵育时间下流动时间与金黄色葡萄球菌浓度之间的线性关系。（f）选择性测试。误差棒表示标准差（n = 3）。

为了验证平台在复杂基质中的可用性，本研究进一步将体系用于人尿、橙汁和湖水等真实样品。首先，不同样品基质本身的流动时间与 PBS 相近，说明体系具有较好的抗基质干扰能力。随后，研究者采用标准加入法向三类样品中加入 0、10^2、10^4、10^6 和 10^8 CFU/mL 的金黄色葡萄球菌。结果表明，在 4 h 孵育条件下，平台可有效覆盖 10 至 10^4 CFU/mL 的检测范围；在 7 h 孵育条件下，则可覆盖 10^4 至 10^7 CFU/mL 的检测范围，显示检测灵敏度与孵育时间密切相关。

值得一提的是，这些真实样品在检测前不需要复杂预处理，只需与培养基按 1:9 体积比混合即可进入分析流程。本研究还开发了一款名为“Data Analyzer”的安卓智能手机应用，将线性拟合方程写入程序后，可以直接输入流动时间并实时换算细菌浓度。以尿液样品为例，应用程序能够读出 10^2、10^4 和 10^6 CFU/mL 金黄色葡萄球菌在 7 h 孵育后的检测结果。整体回收率为 91.2% 至 114.0%，相对标准偏差低于 8.8%；与平板计数法相比，两种方法的相对差异在 88.6% 至 111.8% 之间，说明该平台在实际样品中具有较高可靠性。

图5. MPG 生物传感器在真实样品中检测金黄色葡萄球菌。（a）人尿样品中不同浓度金黄色葡萄球菌在不同孵育时间下的流动时间变化。（b）橙汁样品中不同浓度金黄色葡萄球菌在不同孵育时间下的流动时间变化。（c）湖水样品中不同浓度金黄色葡萄球菌在不同孵育时间下的流动时间变化。I：4 h；II：7 h。（d）用于数据处理的智能手机应用程序界面。误差棒表示标准差（n = 3）。

在药敏测试方面，本研究进一步把同一平台拓展到最小抑菌浓度判定。作者先将金黄色葡萄球菌培养至对数生长期，再把最终菌浓度调至约 5×10^6 CFU/mL，并确定 6 h 为后续药敏测试的最佳孵育时间。实验显示，单独加入金黄色葡萄球菌时，明胶溶液流动时间约为 23.5 s；而加入羧苄西林后，流动时间上升到 45 s，说明药物抑制了细菌活性并减少了明胶酶产生，进而使微孔膜堵塞效应恢复。

在五种抗生素测试中，卡那霉素、多黏菌素 B、万古霉素、阿奇霉素和羧苄西林的浓度从 0.031 至 32 μg/mL 逐步升高时，流动时间都呈现显著增加趋势，表明平台能够区分不同药物浓度下的抑菌强弱。活/死菌染色结果进一步显示，随着羧苄西林浓度增加，代表活菌的绿色荧光不断减弱，并在 4 μg/mL 时完全消失，从侧面支持了流动时间延长与细菌存活下降之间的对应关系。

更关键的是，本研究利用“流动时间不再继续变化”的拐点来判定最小抑菌浓度，并给出了五种抗生素的 MIC：卡那霉素 0.062 μg/mL、多黏菌素 B 2 μg/mL、万古霉素 0.5 μg/mL、阿奇霉素 0.25 μg/mL、羧苄西林 2 μg/mL。与传统肉汤微量稀释法相比，这些 MIC 结果保持一致，说明 MPG 生物传感器的判定准确可靠；更重要的是，传统肉汤法通常需要 18 至 24 h，而本研究只需 6 h 即可完成药敏分析，检测效率得到明显提升。

图6. MPG 生物传感器用于抗菌药物敏感性测试。（a）不同实验条件下的流动时间变化。（b）不同抗生素浓度下的流动时间响应结果。（c）不同浓度羧苄西林处理后金黄色葡萄球菌的活/死菌染色结果。I：0 μg/mL；II：0.25 μg/mL；III：1 μg/mL；IV：4 μg/mL。比例尺为 25 μm。（d）MPG 生物传感器与传统肉汤微量稀释法测得的最小抑菌浓度（MIC）比较结果。

综合来看，这一平台的优势可以概括为四点：其一，检测限低至 1 CFU/mL，表现出极高灵敏度；其二，依据孵育时间不同可覆盖跨越多个数量级的定量范围；其三，在同一平台内同时整合了病原检测与抗菌药物敏感性测试；其四，系统只需要微量注射泵和智能手机即可完成读数，整体构型简单、成本较低、便于携带。与此同时，本研究也坦诚指出，目前体系仍需要 4 至 8 h 的细菌培养时间以及约 30 min 的酶响应过程，且原型装置依赖外接泵，这些因素仍会限制其在即时床旁检测中的进一步应用。

综上所述，本研究开发了一种面向金黄色葡萄球菌检测与抗菌药物敏感性测试的微孔膜聚合物门控生物传感器。该系统通过监测明胶穿过微孔膜时的流动时间变化，将金黄色葡萄球菌分泌明胶酶引起的聚合物水解转化为可直接读取的分析信号，不仅在真实样品中实现了可靠检测，而且能够在 6 h 内给出与传统方法一致的最小抑菌浓度结果。凭借高灵敏度、低成本、操作简便和平台一体化优势，这一策略为病原菌现场检测和快速药敏评估提供了新的技术路径，也为后续向手持化、小型化和更短培养时间方向演进留下了清晰空间。

论文来源：https://doi.org/10.1016/j.bios.2026.118732