近实时流式细胞术：为高山岩溶饮用水微生物安全装上 “预警雷达”

研究背景

岩溶地下水是全球重要饮用水来源，约 10% 人口依赖岩溶含水层供水。但岩溶含水层过滤能力弱，降水事件易引发地表污染物快速入渗，其中粪便污染及肠道致病菌是核心健康风险。传统微生物培养法耗时费力、结果滞后，无法捕捉水文事件引发的短期水质波动，难以满足实时监测需求。虽 UV₂₅₄、浊度等理化参数可近实时监测，但缺乏微生物特异性。自动化现场监测技术（AOM）的兴起，为突破这一瓶颈提供可能，其中流式细胞术可快速测定总细胞数（TCC）、完整细胞数（ICC），在岩溶泉水微生物动态追踪中展现潜力，但此前缺乏长期、多参数、系统性的现场应用验证。

研究内容

研究以奥地利北石灰岩阿尔卑斯山典型岩溶泉 LKAS8 为对象，采用嵌套式 10 年研究设计，融合低频长期监测（2012-2021 年）与 2020-2021 年夏季高频事件采样，系统开展四大核心研究：

1.构建覆盖水文、污染动态的多参数数据集，同步采集微生物、理化、气象水文数据；

2.对现场自动化流式细胞仪（FCM_b）开展方法验证，对比落射荧光显微镜（EFM）、实验室流式细胞仪（FCM_a）；

3.评估 FCM 参数（TCC、ICC、指纹图谱）指示地表微生物输入（SRI）与间接指示弥散性粪便污染（DFC）的能力，对照 UV₂₅₄、浊度及传统微生物指标；

4.借助随机森林、线性判别分析等机器学习，筛选最优参数组合，构建污染早期预警模型。

图1 本研究中应用的嵌套抽样设计。基于用于微生物分析的每月样品采集的长期监测（LTM）数据，HFS 活动在2020年和2021年的夏季进行。与2020年相比，当时基于培养的指标和遗传标记每周测定两次，在已识别的降水事件期间（“事件采样”），采样频率延长为每天4次。

图2 长期水质监测。月度长期监测结果，显示2012年1月至2021年12月期间的水文气象（A）、理化（B）和微生物（C–E）参数。EFM 荧光显微镜，FCM_a:实验室流式细胞仪，HNA 高核酸含量细胞，TCC 总细胞数，大肠杆菌 Escherichia coli，16S 16S rRNA 基因，AllBac 土壤和粪便相关通用拟杆菌门标记，BacR 粪便相关反刍动物特异性拟杆菌门标记，ME 标记当量，MPN 最可能数法。

图3 高频采样。2020年和2021年夏季进行的两次高频采样活动结果：水文和气象参数（A）、物理化学参数（B）以及微生物参数（C–F），采样时间为2020年7-9月和2021年5-9月。与参考期或“基础流量”条件相比，降水事件条件定义为降水量超过> 40 mm/天。每次事件的累计降水量如下：154.2 mm（E1，2020/08/04–08/18）、119.6 mm（E2，2020/08/18–09/01）、131.4 mm（E3，2020/09/01–09/27）、137.9 mm（E4，2021/07/17–08/01）、123.0 mm（E5，2021/08/01–08/19）及132.5 mm（E6，2021/08/19–09/24）。3C：由于TCC数据在对数尺度上与ICC数据重叠，几乎不可见。2020年8月15日至8月15日期间没有细胞计数数据（灰色阴影区域，由于停电缺失92个数值）。FCM_b 自动化近实时流式细胞仪，HNA 高核酸含量细胞，ICC 完整细胞计数，TCC 总细胞计数，大肠埃希菌（E. coli），16S 16S rRNA基因，AllBac 土壤和粪便相关通用拟杆菌标记，BacR 粪便相关、反刍动物特异性拟杆菌标记，ME 标记等效量，MPN 最大可能数。

研究结果

1.水质动态特征清晰

该泉流量季节性差异显著，春季融雪与夏季强降雨形成流量峰值，冬季流量稳定。微生物参数呈明显季节规律，夏季总细胞数、总大肠菌群、大肠杆菌、反刍动物粪便标记物 BacR 等浓度显著高于冬季，99.8% 的大肠杆菌来自反刍动物粪便，夏季是污染高风险期。

2.FCM 监测精准可靠

现场 FCM_b 在野外恶劣条件下稳定运行，TCC、ICC 变异系数（CV）分别为 6.71%、7.19%，重复性与再现性优异。与 EFM、FCM_a 及 16S rRNA 基因标记物高度相关，相关系数最高达 0.98，方法一致性良好，可精准量化微生物细胞。

3.污染指示能力突出

高频采样期内，FCM 参数与总大肠菌群、通用粪便标记物 AllBac（SRI 指标）相关系数 0.59-0.76，与大肠杆菌、BacR（DFC 指标）相关系数 0.61-0.88，余弦相异指数相关性最优。UV₂₅₄、浊度表现相近，两类指标均对粪便污染相关性更强，证实 FCM 可有效间接指示弥散性粪便污染。

4.预警模型性能优异

随机森林模型预警效果更佳：大肠杆菌（≥5 MPN/100mL）最优单参数精度 0.94，FCM 参数组合 + 相异指数精度升至 0.98；BacR（≥100 ME/100mL）最优双参数组合精度 0.93；地表输入指标预测精度最高达 0.95，多参数组合显著优于单一指标。

5.菌群指纹可区分污染状态

基于 FCM 三维数据的余弦相异指数与独立成分分析（ICA），可清晰区分基流与污染事件菌群结构，精准识别 5 次污染事件，直观反映微生物群落定性变化。

图4 FCM和物理化学参数的指标容量。基于近实时FCM和实时物理化学参数指示表面相关输入及现场额外弥散粪便污染：微生物（TCC、HNAP和不相似性评分）和物理化学参数（UV254，浊度）对表面相关污染指标（通用：总大肠菌群和Allbac；粪便：大肠埃希氏菌和BacR）的散点图和Spearman等级相关系数（r = ρ），数据来源于LTM和HFS 2021。HFS = 灰色点，事件4 = 浅红点，事件5 = 中红点；事件6 = 深红点。灰色相关系数对应LTM数据，红色相关系数对应HFS2021事件。ρ值后的星号表示相关为零的概率。*p ≤ 0.05；**p ≤ 0.01；***p ≤ 0.001。EFM 荧光显微镜，FCM_b 自动近实时流式细胞仪，HNA 含高核酸细胞，ICC 完整细胞计数，大肠埃希氏菌 E. coli，AllBac 土壤和粪便相关通用拟杆菌标记，BacR 粪便相关反刍动物特异性拟杆菌标记，ME 标记当量，MPN 最可能数。

图5 使用FCM指纹进行早期预警。2020年和2021年夏季的流式细胞术（FCM）差异性评分：FCM_b_ICC指纹嵌入的独立成分分析（ICA），每个点代表一次测量。点的排列基于独立成分上权重的距离，距离越近表示相似性越高。数据展示了2020年和2021年的高频采样年份。点的颜色编码表示不同事件：蓝色：2020年数据。浅蓝色对应特定事件时期，深蓝色表示基流。红色：2021年数据。深红色对应特定事件时期，深红色表示基流。X表示被归类为不相似的数据点，而圆圈表示通过DS分析与参考时期相似的数据点。基流对应每年的DS参考时期。

图6 新旧细胞计数参数的一致性。修改后的Bland-Altman图用于显示FCM_b和EFM测量的一致性。将FCM_b_TCC与EFM_TCC（n=69）的平均差异[%]绘制在各自方法的平均值上。颜色表示样本来源（事件1-6；LTM：长期监测的每月样本；Baseflow2020）。中央的绿色水平线表示两种方法之间的平均差异，其他两条水平虚线表示一致性界限（平均百分比差异 ± 1.96标准差）

技术优势

1.近实时高效：单样本检测约 20 分钟，远快于传统培养法（18-24 小时），可捕捉短期水质波动；

2.野外适应性强：可在偏远岩溶泉现场稳定运行，适配高湿度、复杂水文等恶劣环境；

3.多维度监测：同时提供定量细胞计数与定性群落指纹，兼顾数量与结构变化；

4.预警价值高：结合理化指标构建多参数模型，预警精度高、响应及时，支撑主动防控；

5.方法兼容性好：与传统显微镜、实验室 FCM 结果高度一致，便于现有体系衔接。

结论与展望

此研究证实，近实时自动化流式细胞术是高山岩溶饮用水源地微生物现场监测的高效工具，可稳定量化微生物、精准指示地表输入与弥散性粪便污染，与理化指标联用构建的早期预警体系，能大幅提升岩溶水安全管理效率。

当前技术可实现弥散性动物粪便污染间接检测，未来需聚焦两大方向突破：一是研发靶向粪便致病菌的特异性标记方法，结合流式 FISH、免疫磁分离等技术，实现粪便污染精准溯源；二是拓展病毒等病原微生物检测能力，推动技术从通用微生物监测向病原靶向检测升级。同时，该成果可推广至同类岩溶、裂隙地下水系统，结合水文地质特征定制监测方案，为全球饮用水安全规划提供数字化、智能化微生物监测新路径。

原文链接：https://doi.org/10.1038/s41545-025-00536-5