从菌株到多肽只需1小时：自动化蛋白质组平台如何加速微生物细胞工厂设计？

随着合成生物学与代谢工程的快速发展，微生物细胞工厂已广泛应用于医药、能源、化工及农业等领域。为了提升目标产物合成效率，研究者通常需要对菌株进行大规模基因编辑与代谢重编程。然而，蛋白表达调控具有高度复杂性，不同工程改造往往会引发宿主细胞代谢网络的系统性变化，因此，仅依赖基因层面分析已难以满足精准设计需求。基于质谱的蛋白质组学能够直接解析细胞内蛋白表达动态，是理解代谢重构机制和优化细胞工厂的重要工具。
       当前高通量菌株构建速度已远超传统蛋白质组学样品处理能力。现有方法普遍存在步骤繁琐、人工依赖高、重复性不足以及处理周期长等问题，严重制约了大规模菌株筛选与“设计—构建—测试—学习（DBTL）”循环效率。因此，开发一种兼具高通量、高重复性与自动化能力的蛋白质组样品制备平台，已经成为推动微生物细胞工厂理性设计的重要需求。

一、 设计原理

研究提出了一种“Strain-to-Peptide Conversion（SPC）”自动化策略，通过将磁性固相烷基化材料（mSPA）与自动化液体处理平台结合，实现了菌株裂解、蛋白富集、去污染及酶解等步骤的一体化整合（图1）。该设计的核心思想，是利用磁珠对蛋白进行快速捕获与纯化，并借助96孔自动化体系实现大规模并行样品处理，从而让蛋白质组学分析速度能够真正匹配高通量菌株构建需求。相比传统依赖人工操作的蛋白前处理流程，该策略不仅减少了样本转移与离心步骤，也降低了人为误差对实验结果的影响。研究希望借助这一平台，不仅提高蛋白质组分析效率，还进一步解析工程菌株在代谢重编程过程中发生的全局蛋白表达变化。

图1  SPC自动化高通量蛋白质组分析平台的构建原理与工作流程

二、 高通量SPC平台的性能验证与系统级代谢重塑分析

研究对酶解条件和蛋白回收效率进行了系统评估。结果发现，在优化条件下，SPC平台能够在显著缩短处理时间的同时保持较好的蛋白鉴定深度；与传统SP3方法相比，SPC在1小时处理流程下仍表现出良好的蛋白和肽段鉴定能力（图2）。同时，自动化autoSPC平台降低了人工操作带来的变异，不同批次之间Pearson相关系数超过0.95，说明该平台具有较高重复性和稳定性。研究还进一步比较了不同蛋白类别的检测能力，发现SPC对膜蛋白的定量能力提高约28%（图2）。

图2  SPC策略与传统SP3方法的性能比较与蛋白检测能力评估

在完成平台性能验证后，研究进一步将SPC应用于大规模工程菌株分析。研究者从ASKA文库中选取了16株携带不同TCA循环相关蛋白编码质粒的大肠杆菌菌株，并在未诱导和IPTG诱导条件下进行比较，利用SPC平台开展高通量蛋白质组学分析（图3）。结果共鉴定到2656个蛋白，其中53.1%的蛋白在16个菌株组中均可检测到，而15.2%的蛋白表现出菌株组特异性检测特征（图3）。这一现象说明，虽然细胞基础生命活动维持相对稳定，但不同代谢工程改造会显著改变特定功能模块的蛋白表达。

图3  TCA循环相关大肠杆菌工程菌株的大规模蛋白质组分析

进一步分析发现，当TCA循环相关酶被过表达后，细胞不仅在中心代谢通路上发生变化，还在翻译、氨基酸代谢、跨膜运输及能量转换等多个功能模块中出现显著蛋白重塑（图4）。例如，部分核糖体相关蛋白表达下调，提示TCA循环相关酶过表达可能对细胞翻译过程造成影响；同时，多种跨膜信号受体和ABC转运蛋白发生表达变化，反映出细胞正在重新调整物质运输、趋化响应和能量资源分配。这些结果表明，工程菌株中的代谢重编程并不是单一路径的局部变化，而是涉及细胞整体资源分配网络的系统性调整。

图4  TCA相关蛋白过表达后的差异蛋白功能分析

三、结论

本研究构建了一种基于mSPA磁珠与自动化液体处理系统的SPC高通量蛋白质组平台，实现了从工程菌株到质谱检测多肽的一体化自动化处理（图1）。相比传统方法，该平台显著缩短了样品处理时间，同时提高了批次稳定性和膜蛋白检测能力，并成功应用于大规模工程菌株蛋白质组解析。研究的创新性在于，将自动化高通量处理、mSPA磁珠富集和快速酶解整合到微生物细胞工厂蛋白质组前处理流程中，使蛋白质组分析效率能够更好匹配当前快速发展的菌株构建需求。但该研究仍存在一定局限性。例如，SPC平台已在大肠杆菌中进行了较系统的性能验证和TCA循环工程菌株应用分析，并初步验证了其在谷氨酸棒杆菌中的适用性，但其在更多微生物种类、复杂样品和不同培养条件下的普适性仍需进一步评估；此外，在高通量条件下，部分低丰度蛋白的检测深度仍有提升空间。未来，该平台有望进一步结合DIA质谱、多酶联合消化以及人工智能数据分析技术，从而提升跨物种适配能力和系统生物学解析深度，为下一代智能化微生物细胞工厂设计提供更强支撑。

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.biortech.2026.134010