Food Chemistry：粒径可调聚集诱导发光纳米颗粒提升 RPA-CRISPR 试纸条灵敏度，实现超灵敏金黄色葡萄球菌检测

金黄色葡萄球菌是食品安全领域最常见、也最具危害性的食源性致病菌之一，不仅可引起典型食物中毒，还与菌血症、感染性心内膜炎以及皮肤软组织感染等多种临床问题相关。传统培养法虽然仍是经典检测路径，但通常需要 3 - 5 d 才能完成判定，难以满足现场快速筛查需求。PCR 等核酸检测方法虽然在灵敏度和特异性上具有优势，却依赖完善实验室、专业仪器和训练有素的操作人员，因此在基层实验室和资源受限地区的推广仍然受限。围绕这一现实需求，开发一种兼具体积小、速度快、灵敏度高且适合现场使用的检测技术，已经成为食品微生物快速检测的重要方向。

近年来，CRISPR/Cas12a 凭借对目标双链 DNA 的特异识别以及被激活后的旁切活性，成为分子诊断中极具吸引力的信号放大工具。为了实现便携式读出，研究者常将其与侧向层析试纸条结合，形成能够在现场完成可视化判断的 CRISPR-LFA 体系。然而，多数现有体系仍以金纳米颗粒作为显色探针，受限于小粒径金纳米颗粒较低的摩尔消光系数，信号强度和检测灵敏度提升空间有限；若一味增大金纳米颗粒尺寸，又会因为散射增强而带来更高背景，反而削弱条带判读效果。如何在不显著抬高背景的前提下提升试纸条信号输出，成为这一类方法继续向超灵敏方向推进的关键瓶颈。

本研究将聚集诱导发光材料引入侧向层析体系，提出以聚集诱导发光纳米颗粒作为新型信号探针的解决思路。与传统荧光染料在聚集状态下往往发生荧光猝灭不同，聚集诱导发光分子在聚集后反而能够释放更强荧光信号。研究者据此推断，如果把这类分子封装成粒径可调的纳米颗粒，随着颗粒变大，单颗粒内可容纳的发光分子数量有望增加，从而提高每个纳米探针的发光强度，并最终转化为更高灵敏度的试纸条读出。为了验证这一判断，本研究没有直接停留在“能不能检测”的层面，而是系统考察了 250、350、450 和 600 nm 四种不同粒径 AIENPs 对检测性能的影响。

方案1. 基于 RPA-CRISPR/Cas12a 的 AIENPs-LFA 试纸条检测金黄色葡萄球菌的原理示意图。提取的基因组 DNA 先经 RPA 扩增，再由 CRISPR/Cas12a 体系识别并触发对 Digoxin-ssDNA-Biotin 报告分子的旁切；当不存在目标双链 DNA 时，完整报告分子可连接抗地高辛单抗标记的 AIENPs，并被测试线上的链霉亲和素捕获产生强荧光信号；当存在目标双链 DNA 时，报告分子被切割，AIENP@mAb 无法在测试线富集，从而导致信号下降。

在基础表征中，透射电镜结果表明四种 AIENPs 都具有均一球形形貌、良好分散性和较窄粒径分布；动态光散射结果进一步确认其水合粒径分别约为 250、350、450 和 600 nm，与显微观察结果一致。更关键的是，当把不同粒径 AIENPs 逐级稀释后直接点样到硝酸纤维素膜上时，本研究观察到随粒径增大，颗粒在相同浓度下所产生的荧光明显增强。这一结果与粒径增大后可装载更多发光分子的预期一致，也说明 AIENPs 的尺寸调控确实能够改变试纸条底物上的信号输出能力。

定量比较显示，250、350、450 和 600 nm AIENPs 在硝酸纤维素膜上形成可检测信号所需的最小颗粒数分别约为 2.9×10^6、1.0×10^6、5.2×10^5 和 2.2×10^5。也就是说，颗粒越大，单位数量颗粒提供的发光贡献越高。从试纸条信号增强的角度看，大粒径 AIENPs 确实更有利于抬高检测强度，这也为后续将其作为 CRISPR-LFA 探针打下了基础。

图1. AIENPs 的粒径表征与发光性能分析。（a–d）粒径分别为 250、350、450 和 600 nm 的 AIENPs 透射电镜图像。（e–h）对应 AIENPs 的动态光散射粒径分布。（i–l）不同粒径 AIENPs 在不同浓度下沉积于硝酸纤维素膜上的荧光强度变化。

不过，本研究并没有简单地把“颗粒越大越好”作为最终结论。研究者进一步把不同粒径 AIENPs 制备成 Digoxin-ssDNA-Biotin 标记探针，并让其在试纸条上通过生物素-链霉亲和素作用在测试线富集。结果显示，随着探针粒径增大，测试线荧光的最低可见浓度依次下降，提示条带灵敏度确实在增强。但当粒径增至 600 nm 时，虽然测试线本身信号更强，测试线前缘也出现了更明显的颗粒残留与背景堆积，导致信噪比下降，并增加假阳性风险。相较之下，450 nm AIENPs 在信号强度和背景控制之间取得了更优平衡，因此被选定为后续体系的最佳探针尺寸。

这一筛选结论非常关键，因为它说明 AIENPs 对试纸条性能的提升并不是单纯依赖更大的粒径，而是存在一个与发光增强、颗粒迁移和膜面残留共同作用的最优窗口。对于现场检测平台而言，真正有价值的不是让条带“更亮”，而是在保持低背景的同时获得更高可分辨性。从这个角度看，本研究不仅提出了新材料，还明确给出了尺寸优化这一关键设计原则。

在完成探针筛选后，本研究进一步构建 CRISPR/Cas12a 介导的 AIENPs-LFA 体系。研究者围绕金黄色葡萄球菌 16S rRNA 目标序列设计了相应 dsDNA 和 crRNA，并先用常规荧光报告分子验证体系可行性。结果表明，随着目标 dsDNA 浓度升高，荧光信号明显增加，而阴性对照几乎不发生变化，说明所设计 crRNA 能够特异识别目标序列并有效激活 Cas12a 的旁切活性。

为了进一步提升条带表现，本研究又系统优化了 Cas12a 与 crRNA 配比、Mg²⁺ 浓度、Digoxin-ssDNA-Biotin 报告分子浓度，以及 AIENP@mAb 制备与测试线构建条件。结果显示，Cas12a 与 crRNA 按 1:1 配比、Mg²⁺ 浓度为 10 mM 时切割效率最佳；报告分子浓度为 1.6 nM 时，体系信噪比最高。在条带制备端，pH 6.0、每毫克 AIENP450 配 50 μg EDC 与 40 μg 抗地高辛单抗、测试线喷涂链霉亲和素 0.6 mg/mL、AIENP@mAb 用量 1.25 μg 时，可获得最优荧光输出。值得注意的是，AIENP@mAb 共轭物和组装完成的试纸条在 37 ℃ 存放 4 周后仍保持稳定荧光信号，条带反应时间则在 15 min 左右达到稳定，这为后续现场应用提供了现实支撑。

图2. CRISPR/Cas12a 体系与 AIENPs-LFA 参数优化。（a-b）Mg²⁺ 浓度以及 Cas12a 与 crRNA 配比对 CRISPR/Cas12a 切割效率的影响。（c）不同 Digoxin-ssDNA-Biotin 报告分子浓度下的 FIT/FIC 比值及信噪比。（d–f）pH、EDC 用量和抗地高辛抗体负载量对 AIENP@mAb 制备的影响。（g–h）测试线上链霉亲和素喷涂浓度和 AIENP@mAb 用量对条带荧光信号的影响。（i）AIENPs-LFA 试纸条的动力学分析。

在灵敏度对比实验中，本研究把优化后的 AIENPs-LFA 与传统 30 nm 金纳米颗粒侧向层析体系放在相同 CRISPR/Cas12a 条件下直接比较。结果显示，AIENPs-LFA 随目标 dsDNA 浓度增加而出现测试线荧光持续下降，并可建立稳定校准曲线，其检测限达到 100 fM；而对照的 AuNPs-LFA 检测限仅为 10 pM。换言之，用 AIENPs 替换传统 AuNPs 作为侧向层析读出探针后，体系灵敏度提升了约 100 倍。这一结果直接证明，聚集诱导发光纳米颗粒不仅可以用于 LFA，更能够实质性突破传统金纳米颗粒在 CRISPR 试纸条中的灵敏度瓶颈。

图3. AIENPs-LFA 与 AuNPs-LFA 对金黄色葡萄球菌目标双链 DNA 的检测灵敏度比较。（a）两种试纸条用于目标 dsDNA 检测的整体应用示意。（b-c）基于 AIENPs-LFA 的条带图像及对应校准曲线。（d-e）基于 AuNPs-LFA 的条带图像及对应校准曲线。

在真实检测流程中，本研究将 RPA 与 CRISPR/Cas12a 进一步串联到 AIENPs-LFA 上，以实现对金黄色葡萄球菌的快速超灵敏分析。提取的基因组 DNA 先经 15 min RPA 扩增，再进入 30 min Cas12a 切割反应，最后通过 AIENPs 试纸条进行 15 min 读出。条带结果显示，随着金黄色葡萄球菌浓度上升，测试线荧光逐渐减弱，并在 2.4×10^5 CFU/mL 附近趋于平台。定量分析表明，在 2.4 至 2.4×10^4 CFU/mL 范围内，FIT/FIC 与菌浓度之间呈良好线性关系，回归方程为 y = -0.095 ln(x) + 1.1108，R² = 0.9971。

按照阴性样本平均值减去 3 倍标准差的标准，本研究将该体系对金黄色葡萄球菌的检测限确定为 9.95 CFU/mL。文章还进一步估算，这一细胞浓度对应的基因组当量浓度约为 8.62×10^-20 mol/L，说明该体系在分子层面的放大能力非常突出。与文中比较的大多数既有 CRISPR-LFA 平台相比，这一灵敏度已经处于相当有竞争力的水平。

特异性方面，本研究选取了多种常见食源性致病菌作为干扰对象，包括阪崎肠杆菌、蜡样芽孢杆菌、单核细胞增生李斯特菌、副溶血弧菌、大肠杆菌 O157:H7、志贺菌和鼠伤寒沙门氏菌，并且这些非目标菌的测试浓度设为 3×10^4 CFU/mL，比检测用金黄色葡萄球菌高 10 倍。结果显示，这些非目标菌的 FIT/FIC 值与阴性对照基本一致，而金黄色葡萄球菌则引起显著信号下降，证明该平台具有很好的种属识别专一性。

图4. RPA-CRISPR/Cas12a 介导的 AIENPs-LFA 用于检测金黄色葡萄球菌。（a）RPA-CRISPR/Cas12a-AIENPs-LFA 检测流程示意图。（b）针对金黄色葡萄球菌 16S rRNA 序列设计的 RPA 引物。（c）不同浓度金黄色葡萄球菌检测时的试纸条图像。（d）FIT/FIC 与细菌浓度之间的校准曲线。（e）利用常见食源性致病菌进行的特异性评价。NC 为阴性对照；1 为金黄色葡萄球菌；2 为阪崎肠杆菌；3 为大肠杆菌 O157:H7；4 为鼠伤寒沙门氏菌；5 为蜡样芽孢杆菌；6 为单核细胞增生李斯特菌；7 为志贺菌；8 为副溶血弧菌。

为了验证真实食品基质中的适用性，本研究又在人为加标巴氏杀菌乳中开展了准确性和精密度测试。研究者将金黄色葡萄球菌按 10^2、10^3 和 10^4 CFU/mL 三个水平加入牛奶样品，经 DNA 提取后按相同流程完成 RPA、CRISPR/Cas12a 反应及 AIENPs-LFA 分析，并连续 3 d、每天 5 次重复评估批内和批间表现。结果显示，批内回收率为 84.85% 至 106.93%，批间回收率为 83.13% 至 101.93%，相对标准偏差均低于 14.42%。这些数据表明，该平台在复杂乳样基质中仍然保持较高准确性与良好重复性，并没有因样品背景而显著失真。

从应用角度看，这项研究最重要的意义并不只是又做出了一条新的 CRISPR 试纸条，而是明确提出并验证了“通过探针粒径设计提升 AIENPs-LFA 灵敏度”的策略。传统思路往往更关注引物设计、酶切体系或样品前处理，而本研究把注意力前移到了信号探针本身，并证明粒径调节可以显著改变条带的背景、亮度和最终检测限。这种从材料维度切入的优化方式，为今后 CRISPR 侧向层析平台的性能升级提供了新的工程化路径。

综上所述，本研究成功构建了一种基于 450 nm 聚集诱导发光纳米颗粒的 RPA-CRISPR/Cas12a 侧向层析平台，用于金黄色葡萄球菌的快速超灵敏检测。得益于 450 nm AIENPs 更优的发光性能和更低背景干扰，该平台相较传统 AuNPs-LFA 实现了约 100 倍灵敏度提升；在与 RPA 和 Cas12a 联用后，检测限进一步达到 9.95 CFU/mL，并在加标牛奶样品中验证了良好的准确性、精密度和鲁棒性。作为一种便携、快速、用户友好的检测方案，这一平台为食源性致病菌现场监测提供了新的技术基础，也展示了聚集诱导发光材料与 CRISPR 诊断深度结合在食品安全领域的应用潜力。

论文来源：https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2026.149477