Chemical Engineering Journal：分子印迹磁性 CoFe 氧化物纳米酶实现对金黄色葡萄球菌的同步去除与无标记定量检测

在液态食品污染控制中，真正棘手的问题往往不只是“能不能检测到病原菌”，还包括“能不能在检测的同时把它们有效去除”。金黄色葡萄球菌作为常见食源性致病菌，不仅可引起恶心、呕吐、腹痛和腹泻等胃肠道问题，还可能在不利环境下进入可存活但不可培养的 VBNC 状态。这类细菌虽然在常规培养检测中容易漏检，却仍保留膜完整性、基础代谢能力以及在条件恢复后重新致病的潜力，因此对食品安全和公共卫生构成持续威胁。围绕这一挑战，本研究尝试把“特异捕获”“磁分离去除”和“快速定量检测”三种功能合并到一种单一材料中。

目前常见的磁性纳米材料策略大多依赖抗体、适配体或抗生素等识别元件来实现病原富集和检测。它们虽然在某些场景中有效，但普遍面临特异识别元件来源有限、稳定性不够、抗药性影响明显或目标谱过窄等问题。相比之下，分子印迹聚合物作为人工受体，理论上兼具较高亲和力、可设计性和更好的稳定性。如果能把分子印迹层嫁接到兼具磁响应和类酶催化活性的纳米酶表面，就有机会同时完成目标细菌的选择性识别、快速分离和无标记检测。难点在于，细菌本身尺寸大、表面官能团复杂、易变形，直接拿完整活菌做模板并不容易得到结构稳定、厚度可控的印迹层。

本研究的创新点正在于此。研究者没有直接使用整个活菌做模板，而是提出“来源于活菌的表面片段印迹”策略：先用带有苯硼酸识别基团的 pH 响应型 CoFe 氧化物纳米酶捕获金黄色葡萄球菌，再利用糖苷水解酶对其进行切割，得到保留关键三维结构特征的表面片段，随后在其外部形成聚多巴胺印迹层，去除模板后得到目标导向的 MIP@B-CoFeO 核壳纳米酶。这一设计让材料既保留了磁性氧化物的快速分离能力和类过氧化物酶活性，又获得了对目标菌的结构性识别位点。

方案1. 核壳型 MIP@B-CoFeO 纳米酶的构建原理示意图。（a）pH 响应型 B-CoFeO 纳米酶的合成路线。（b）针对金黄色葡萄球菌的 MIP@B-CoFeO 纳米酶合成流程：先由 B-CoFeO 捕获目标菌，再经糖苷水解酶切割得到细菌表面片段模板，随后通过聚多巴胺包覆形成印迹层，去除模板后获得具有特异识别腔体的核壳纳米酶。

在核心纳米酶的构建与筛选阶段，本研究首先通过水热法制备 carboxyl-CoFe oxides（C-CoFeO）纳米酶，并围绕 Co/Fe 配比系统评估其催化性能。结果显示，在 luminol/H₂O₂ 体系中，Co 元素对化学发光催化贡献更突出；而在 TMB/H₂O₂ 体系中，Fe 元素则更有利于显色反应。随着 FeCl₃·6H2O 投料量从 1 g 增加到 3 g，材料在 TMB/H₂O₂ 体系中的催化能力持续增强，但继续增加到 4 g 和 5 g 时，平均粒径显著增大、比表面积下降，催化活性反而回落。最终，投料比对应 3 g FeCl₃·6H2O 的 C-CoFeO-3 g 被确定为最佳核心材料。

这一最佳纳米酶在结构和性能上都具备较好的平衡性。其平均粒径约为 163.5 nm，明显小于高 Fe 投料条件下形成的大颗粒材料；磁滞回线测试显示其饱和磁化强度达到 42.8 emu/g，说明具有较强磁响应，便于从液体样品中快速分离；XRD 和 XPS 分析进一步证明材料中 Co 和 Fe 已成功组成双金属氧化物结构，并且 Co²⁺/Co³⁺ 和 Fe²⁺/Fe³⁺ 比例相近，这种双价/三价金属离子共存状态被认为有利于 Fenton 或类 Fenton 催化循环。

图1. C-CoFeO 纳米酶的物理化学性质与类过氧化物酶活性表征。（a）对 luminol/H₂O₂ 体系的催化性能比较。（b）对 TMB/H₂O₂ 体系的催化性能比较。（c）不同 FeCl₃·6H2O 投料条件下 C-CoFeO 纳米酶的粒径分布及平均粒径。（d）C-CoFeO 纳米酶的磁滞回线。（e）C-CoFeO 纳米酶的 XRD 图谱。（f–i）C 1s、O 1s、Co 2p 和 Fe 2p 的 XPS 高分辨谱图。

在此基础上，本研究继续通过 EDC/NHS 反应将 3-氨基苯硼酸接枝到 C-CoFeO 表面，得到带有苯硼酸识别基团的 B-CoFeO 纳米酶。苯硼酸基团在碱性条件下可与含 cis-diol 结构的分子形成环状酯键，因此既能识别腺苷，也有望识别革兰氏阳性菌细胞壁中相关结构。紫外可见光谱验证显示，B-CoFeO 能显著捕获含 cis-diol 的腺苷，而对缺乏该结构的脱氧腺苷仅表现为轻微物理吸附，证明表面修饰成功。

进一步使用菌落计数法评价 B-CoFeO 对金黄色葡萄球菌的识别能力后，本研究确定 C-CoFeO 与 3-APBA 的最佳质量比为 1:1。在这一条件下，残余金黄色葡萄球菌数量最低，说明苯硼酸位点数量和材料表面状态更适合细菌捕获。与此对应，材料在 pH 4 条件下的 zeta 电位也表现出最优变化，进一步支持这一修饰比例是构建后续印迹壳层的最佳基础。

图2. B-CoFeO 纳米酶的识别性能及表面修饰优化。（a）B-CoFeO 对腺苷和脱氧腺苷识别能力的紫外可见光谱比较。（b）利用菌落计数法评估 B-CoFeO 识别金黄色葡萄球菌的原理示意图。（c）不同 C-CoFeO/3-APBA 质量比条件下残余金黄色葡萄球菌数量比较（n = 3）。（d）不同 C-CoFeO/3-APBA 质量比条件下纳米酶的 zeta 电位变化。

完成表面修饰后，本研究进入印迹层构建与识别腔优化阶段。研究者通过调节多巴胺自聚时间来控制印迹层厚度，并以残余金黄色葡萄球菌数量和印迹因子作为评价指标。结果显示，自聚 60 min 时材料对金黄色葡萄球菌的识别能力最佳，印迹因子达到 4.72，说明这一厚度下形成的印迹层既足够保留模板片段空间特征，又不会因为过厚而妨碍细菌进入识别腔。

多种表征结果共同证明了 MIP@B-CoFeO 的成功构建。XPS 中可检测到 B 和 N 元素，说明苯硼酸修饰与聚多巴胺包覆都已实现；TEM 图像则可见致密深色 CoFeO 核与外层透明聚合物壳的典型核壳结构。荧光显微镜结果进一步显示，与非印迹材料相比，MIP@B-CoFeO 能明显诱导金黄色葡萄球菌聚集成团，提示其对目标菌具有更强结合能力。与此同时，随着逐层修饰进行，材料平均粒径由 C-CoFeO 的 141.7 nm 增至 B-CoFeO 的 178.5 nm，再增至 MIP@B-CoFeO 的 270.1 nm，也从侧面验证了核壳结构确已形成。

图3. MIP@B-CoFeO 纳米酶的结构表征与印迹识别性能评价。（a）MIP@B-CoFeO 纳米酶的 XPS 全谱。（b）B 1s 高分辨谱图。（c）N 1s 高分辨谱图。（d）MIP@B-CoFeO 纳米酶的 TEM 图像。（e）利用菌落计数法比较 MIP 和 NIP 纳米酶处理后残余金黄色葡萄球菌数量。（f）不同聚合时间条件下 MIP@B-CoFeO 纳米酶的印迹因子。（g–i）荧光显微镜下金黄色葡萄球菌与 NIP、MIP 纳米酶作用后的聚集状态。

在特异性识别方面，本研究给出了相当有说服力的数据。面对同时含有金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的混合体系，NIP@B-CoFeO 对两种细菌都只表现出有限吸附，而 MIP@B-CoFeO 处理后，大肠杆菌仍有约 1.04×10^3 CFU/mL 留在溶液中，保留率超过 75%；相比之下，金黄色葡萄球菌仅剩约 5.0×10^1 CFU/mL，残留率约 20.83%，说明其捕获效率接近 79.17%。这意味着该材料在混合菌环境中已能明显偏向性地去除目标菌。

为了进一步排除“只是因为球菌和杆菌形态不同才容易区分”的干扰，本研究又引入两种球形革兰氏阳性竞争菌，即溶血葡萄球菌和乳房链球菌。结果显示，在与溶血葡萄球菌的对比中，MIP@B-CoFeO 对金黄色葡萄球菌的捕获效率达到 91.32%，而对溶血葡萄球菌仅为 31.07%；即便面对尺寸更小的乳房链球菌，材料依然优先识别和捕获金黄色葡萄球菌。扫描电镜图像也直观显示，MIP@B-CoFeO 更倾向于聚集在金黄色葡萄球菌周围，而在大肠杆菌附近则几乎不富集。这说明其选择性并非仅来自静电吸附，而主要源于印迹腔对目标表面片段空间结构的匹配。

图4. MIP@B-CoFeO 纳米酶对金黄色葡萄球菌的特异识别性能。（a）利用菌落计数法评价 MIP@B-CoFeO 从含金黄色葡萄球菌和大肠杆菌混合体系中选择性识别目标菌的能力。（b–d）MIP@B-CoFeO 分别在金黄色葡萄球菌、大肠杆菌及其混合体系中识别后的扫描电镜图像。（e）与溶血葡萄球菌竞争时的识别结果。（f）与乳房链球菌竞争时的识别结果。

在分析检测性能方面，本研究分别建立了化学发光和比色两种无标记读出模式。优化结果显示，在比色体系中，H₂O₂ 最佳浓度为 100 mM，TMB 最佳浓度为 800 μM；在化学发光体系中，H₂O₂ 和 luminol 的最佳工作浓度分别为 10 mM 和 40 mM。随后研究者将 MIP@B-CoFeO 以 1 mg/mL 固定浓度加入 1×10^2 至 1×10^8 CFU/mL 的金黄色葡萄球菌样品中捕获 10 min，再通过磁分离和水洗进入检测步骤。

结果显示，无论是化学发光强度还是比色吸光度，都会随着金黄色葡萄球菌浓度升高而呈现负线性变化，且两种模式的线性相关系数 R² 都超过 0.98。这一负相关关系的机制非常清晰：材料捕获的目标菌越多，越会遮蔽核心纳米酶的催化位点，导致信号输出越弱。基于 3 倍信噪比标准，本研究将化学发光检测限确定为低于 7.76 CFU/mL，比色检测限为 12.59 CFU/mL。结合表 1 的对比可以看出，该体系在 10 min 捕获、5 min 化学发光检测或 15 min 比色检测的条件下，已经达到相当有竞争力的灵敏度。

在准确性和重复性方面，本研究采用标准加入法进行了系统评估。化学发光模式下，加标回收率为 89.64% 至 109.90%，批内 RSD 为 19.96%，批间 RSD 为 15.72%；比色模式下，加标回收率为 60.57% 至 126.52%，批内 RSD 为 24.95%，批间 RSD 为 19.79%。与此同时，材料还表现出不错的再生利用能力：经过 5 次识别-洗涤-解离-再识别循环后，其捕获能力仅由 2.79×10^3 CFU/mg 下降至 2.63×10^3 CFU/mg，降幅仅为 5.73%。这些结果说明，该材料并非只能一次性使用，而是具备一定重复应用潜力。

更值得关注的是，本研究还专门考察了材料对不同状态金黄色葡萄球菌的识别能力。结果表明，在牛奶体系中，无论目标菌处于活菌、死菌还是混合状态，MIP@B-CoFeO 都能与其形成明显聚集，说明其识别基础来自细菌表面片段的空间结构，而不是细胞活性本身。考虑到 VBNC 细菌最难通过常规培养法发现，这一点尤其重要，因为它意味着该材料有望同时覆盖最容易漏检、但仍具潜在风险的那部分病原。

在真实样品验证中，本研究把金黄色葡萄球菌加入牛奶中，使其浓度覆盖 10 至 10^8 CFU/mL，并直接利用 MIP@B-CoFeO 开展检测。结果显示，牛奶基质中的检测表现与磷酸盐缓冲液中基本一致，说明矩阵效应对该体系影响较小。随着金黄色葡萄球菌浓度升高，652 nm 吸光度逐渐下降，在 10 至 10^8 CFU/mL 范围内表现出良好的线性关系，R² 高于 0.91，检测限为 13.13 CFU/mL。这说明该材料不仅能在理想缓冲体系中工作，也能在实际乳样中保持较高的选择性和定量能力。

图5. MIP@B-CoFeO 纳米酶的检测性能、稳定性与实际样品验证。（a-b）TMB/H₂O₂ 比色体系中 H2O2 与 TMB 浓度优化结果。（c-d）luminol/ H₂O₂ 化学发光体系中 H₂O₂ 与 luminol 浓度优化结果。（e）金黄色葡萄球菌浓度与 MIP@B-CoFeO 催化化学发光强度之间的相关关系。（f）金黄色葡萄球菌浓度与 MIP@B-CoFeO 催化吸光度之间的相关关系。（g）MIP@B-CoFeO 纳米酶的再生与重复利用表现。（h）pH 对 MIP@B-CoFeO 识别金黄色葡萄球菌能力的影响。（i-j）利用荧光显微镜评估 MIP@B-CoFeO 对活/死金黄色葡萄球菌的识别效果。（k）MIP@B-CoFeO 在牛奶中检测金黄色葡萄球菌的性能表现。

整项研究的最大价值在于把“去除”和“检测”真正融合在了一起。很多检测策略只解决是否存在病原的问题，但并不承担后续去污功能；而许多去除策略又缺乏定量读出和预警能力。本研究所构建的核壳型 MIP@B-CoFeO 纳米酶则同时具备磁分离、结构识别和催化放大三重功能，可以在复杂液态食品中先把目标菌抓住、再把它们拉出体系，同时依据信号衰减完成无标记定量分析。这种一体化设计对食品企业的早期污染预警和污染控制都有现实意义。

综上所述，本研究开发了一种以细菌表面片段印迹为核心的 MIP@B-CoFeO 核壳磁性纳米酶，用于金黄色葡萄球菌的特异去除与快速定量检测。该体系利用双金属 CoFe 氧化物的类过氧化物酶活性与磁响应能力，结合分子印迹层对目标菌的结构性识别，实现了对活菌、死菌及 VBNC 状态金黄色葡萄球菌的高选择性捕获，并在化学发光和比色模式下分别达到 7.76 CFU/mL 和 12.59 CFU/mL 的检测限，在牛奶中也实现了 13.13 CFU/mL 的检测限。凭借快速捕获、无标记检测、可磁分离去除和一定循环利用能力，这一平台为液态食品中食源性病原的早期预警与污染控制提供了新的技术路径。

论文来源：https://doi.org/10.1016/j.cej.2026.173240