研究背景

酵母是真菌界物种丰富度极高的类群，在食品发酵、生物能源生产中发挥关键作用，而白色念珠菌、新型隐球菌等致病性酵母可引发侵袭性真菌感染，威胁免疫低下人群健康。

传统酵母鉴定依赖表型观察、生化代谢谱分析，存在检测周期长、操作繁琐、近缘物种难区分等问题。分子鉴定如 ITS 测序虽为金标准，但需 DNA 提取与扩增，易交叉污染；免疫法耗抗体、成本高；MALDI‑TOF MS 依赖高精仪器与数据库，基层应用受限。因此，研发快速、简便、低成本的酵母鉴定技术，对食品、临床、环境领域意义重大。

研究内容

团队首次发现双链 DNA 特异性染料 SYBR Green I 对酵母活死细胞具有选择性通透性：活酵母细胞膜完整，染料难以渗透，荧光微弱；死酵母膜通透性剧增，染料大量嵌入双链 DNA，荧光显著增强。

基于此，团队建立热扫描荧光光谱（TSFS） 方法：以 SYBR Green I 为探针，在 37–98℃梯度升温下，实时检测酵母荧光强度变化，记录细胞热响应特征曲线。升温过程中，酵母呈现双相热响应：Ⅰ 相为膜通透性递增、细胞逐步死亡，荧光强度上升；Ⅱ 相为基因组双链 DNA 变性，染料释放，荧光强度下降。不同物种酵母耐热性与 DNA 特性存在差异，形成物种特异性 TSFS 图谱，结合多变量统计分析实现精准分类。

研究选取白色念珠菌、光滑念珠菌、酿酒酵母等 8 种酵母，掺入牛奶构建模拟食品样本，验证 TSFS 用于食品酵母成分分析的可靠性；同时探究细胞浓度、培养阶段、培养温度对光谱重复性的影响，并通过盲样测试、多维度降维分析评估鉴定准确性。

图 1. SYBR Green I 对活/死酵母的选择性通透性。(a1−c1) 对活/死酵母细胞进行 FC 分析，分别为有/无 SYBR Green I 染色的 C. albicans (a1)、C. glabrata (b1) 和 S. cerevisiae (c1)。(a2−c2) 对上述样品进行统计分析。数据以平均值 ± 标准差表示 (n = 5)。星号“**”和“***”分别表示 P < 0.01 和 P < 0.001。

图 2. 活酵母和死酵母的热扫描荧光光谱。(a) 活酵母的热扫描荧光光谱。以白色念珠菌 (C. albicans) 作为酵母模型。蓝色阴影表示细胞死亡阶段，粉色阴影表示双链 DNA 溶解阶段。(b) 上述样品的导数值。半致死温度 (T s) 和双链 DNA 熔解温度 (T m) 分别用蓝色阴影和粉色阴影表示。(c) 温度对细胞存活率的影响，通过平板计数分析。(d) 上述样品的统计分析。数据以均值 ± 标准差 (SD) 表示 (n = 3)。(e) 死酵母的热扫描荧光光谱。(f) 两个生理过程对热扫描荧光光谱形成的示意图。

图3. 不同条件下活酵母的热扫描荧光光谱。(a) 细胞浓度对热扫描荧光光谱的影响。(b) 上述样品的归一化荧光。(c) 上述样品的归一化导数值。(d) 酵母（白假丝酵母）的生长曲线。(e−g) 在三个不同时间点培养的酵母的热扫描荧光光谱。使用Pearson相关分析评估荧光光谱与参考光谱（见图S1）的相似性。数据以均值 ± 标准差表示（n = 3）。(h, i) 在两种不同温度下培养的酵母的热扫描荧光光谱。

图4. 不同酵母的热扫描荧光光谱及其相似性分析。(a−h) C. albicans (a)、R. rubra (b)、C. utilis (c)、C. glabrata (d)、Z. rouxii (e)、C. neoformans (f)、P. pastoris (g) 和 S. cerevisiae (h) 的热扫描荧光光谱。每种酵母菌分别对五个克隆（编号1、2、3、4和5）进行了热扫描荧光光谱分析。实验中使用的菌株为C. albicans 2310号。通过成对比较的皮尔逊相关分析（Figure S3）评估克隆之间的相似性，数据以平均值 ± 标准差表示。(i) 八种酵母混合物的热扫描荧光光谱。(j) 通过皮尔逊相关分析评估物种之间的相似性。红色“#”表示同一属的不同物种（白色念珠菌属）。

研究结果

1.双相特征明确：TSFS 曲线清晰呈现细胞死亡相（37–69℃）与 DNA 变性相（69–98℃），可提取半致死温度 Ts、全致死温度 Tt、熔解温度 Tm 三大特征参数。

2.重复性优异：同一酵母菌株在不同浓度、生长阶段、培养温度下，TSFS 图谱相似度≥0.99，特征温度稳定，不受外界条件干扰。

3.区分效果显著：8 种酵母的 TSFS 图谱具有物种特异性，同物种克隆相似度≥0.99，不同物种相似度＜0.99，同属近缘种相似度约 0.98，统计学差异显著（P＜0.01）。

4.鉴定精度极高：13 株盲样测试中，白色念珠菌匹配准确率 100%；8 种酵母标准库验证，除光滑念珠菌准确率 92% 外，其余 7 种均超 96%。

5.食品样本适用：牛奶混合酵母样本经分离培养后，TSFS 结合 T‑SNE 降维分析，可清晰区分 8 种酵母，高分辨率聚类近缘物种。

图5. 热扫描荧光光谱在酵母鉴定中的准确性。(a, b) 通过对各自的热扫描荧光光谱进行皮尔逊相关分析，评估13种加密酵母菌株与参考C. albicans 2310之间的相似性。a面板中红框标记区域的放大视图显示在c面板中。统计显著差异以双星号表示，P < 0.01。(c) 通过进行96次重复实验，评估将热扫描荧光光谱(TSFS)结合皮尔逊相关分析用于酵母鉴定的准确性。

图6. 通过热扫描荧光光谱的降维分析对酵母菌株进行分类。(a) 样品预处理和TSFS分析的示意图。(b) 八种酵母混合物的TSFS。实验中使用了C. albicans 2310菌株。(c−g) 通过不同的降维方法对酵母菌株进行分类。(c) 主成分分析 (PCA)。(d) 核主成分分析的径向基函数 (KPCArbf)。(e) t分布随机邻居嵌入 (T-SNE)。(f) 线性判别分析 (LDA)。(g) 线性核主成分分析 (KPCAlinear)。椭圆内的区域表示95%置信区间。

技术优势

1.极速高效：全程0.5–2 小时完成鉴定，较传统生化法、ITS 测序的 24–28 小时大幅缩短，与质谱、免疫法速度相当。

2.操作简便：无需 DNA 提取、扩增，无需抗体，普通荧光定量 PCR 仪即可完成检测，基层机构易普及。

3.成本低廉：仅用常规荧光染料与缓冲液，试剂成本低，无需昂贵专用设备。

4.稳定可靠：图谱反映细胞固有耐热性与 DNA 特性，抗干扰强，同物种重复性高，物种级鉴定精准。

结论与展望

研究首次建立热扫描荧光光谱（TSFS） 酵母鉴定新方法，突破传统技术周期长、成本高、操作复杂的瓶颈，实现无抗体、无测序、1 小时内物种级精准鉴定，在食品微生物检测、临床真菌筛查、环境真菌监测领域具备广阔应用前景。

目前该技术标准库仅覆盖 8 种酵母，检测限约 10⁵ cfu/mL，灵敏度有待提升。未来研究将聚焦三大方向：一是构建大规模酵母 TSFS 参考数据库，覆盖更多食品、临床常见物种；二是开发单细胞 TSFS 检测装置，突破批量分析局限，显著降低检测限；三是优化温度梯度参数，进一步提升鉴定准确性与适用场景，推动技术从实验室走向产业化应用。

原文链接：https://doi.org/10.1021/acs.analchem.6c00834