冻干纸芯片联用RT-RPA与CRISPR/Cas12a，实现诺如病毒45分钟手机辅助现场检测

诺如病毒是全球急性非细菌性胃肠炎和食源性暴发中的重要病原，传播力强、感染剂量低、环境稳定性高，但现有核酸检测往往依赖实验室仪器、专业操作和较繁琐的流程，难以适应现场快速筛查需求。本研究围绕这一痛点，提出了一种冻干纸基微流控分析装置，将逆转录重组酶聚合酶扩增与CRISPR/Cas12a识别整合在同一纸芯片上，并进一步配套智能手机辅助荧光检测装置，目标是在便携、低成本条件下实现对诺如病毒的高灵敏现场检测。

从检测逻辑看，本研究构建的lpRPA-Cas平台把样本扩增、特异识别和信号输出串联为一条紧凑流程。诺如病毒RNA加入纸芯片后，可先在预冻干的RT-RPA反应区完成等温扩增；随后通过折叠芯片，使扩增产物与另一侧预冻干的CRISPR/Cas12a反应区接触。一旦crRNA引导Cas12a识别到目标扩增产物，Cas12a的旁切活性便会切断带有荧光-淬灭标记的单链DNA报告分子，释放可测荧光信号，最终再由手机端完成成像和定量分析。整个平台的工作流程和识别原理在文中的主图中被清晰概括。

图1. lpRPA-Cas平台用于检测诺如病毒的示意图。（A）lpRPA-Cas平台的检测流程。（B）lpRPA-Cas平台的检测机制，包括RT-RPA反应、CRISPR/Cas12a反应和信号输出。

在平台构建完成后，本研究重点验证了其分析性能。结果显示，随着诺如病毒RNA浓度升高，芯片荧光强度持续增强，并且在CRISPR/Cas12a反应时间延长时信号也进一步上升。综合不同时间点数据，平台对诺如病毒RNA的检出限可低至1 copy/μL；在60 min CRISPR反应条件下，荧光强度与10^0-10^8 copies/μL诺如病毒RNA浓度之间呈现良好的线性相关，R²达到0.946，说明该体系不仅能做定性筛查，也具备较强的定量分析潜力。围绕这一部分，主图集中展示了灵敏度曲线、线性关系、选择性和稳定性表现。

图2. 平台对诺如病毒RNA的检测性能。（A-C）平台在CRISPR/Cas12a反应不同时间点对诺如病毒RNA的灵敏度检测结果。（D）荧光强度与诺如病毒RNA浓度之间的相关性。（E）平台对诺如病毒相对于其他干扰病毒、细菌、真菌及人细胞成分的选择性。（F）冻干纸基RPA-CRISPR检测1 copy/μL诺如病毒RNA时的8周稳定性与货架期评估。

选择性分析进一步说明，这一平台并未因高灵敏度而牺牲特异性。面对轮状病毒、SARS-CoV-2、单纯疱疹病毒、人乳头瘤病毒、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、B族链球菌、热带假丝酵母以及人基因组DNA等多种潜在干扰物，仅诺如病毒触发了显著荧光增强，提示体系在复杂背景下仍能维持较高识别专一性。与此同时，冻干设计显著提升了使用便利性：纸芯片在约25 ℃室温下保存8周后，仍能稳定检测1 copy/μL目标；即使在37 ℃条件下放置7天，活性也仅出现轻微下降，说明这一平台具备较好的储存稳定性和现场部署可行性。

为检验真实应用能力，本研究将不同浓度的诺如病毒RNA分别加入自来水、生菜上清液和牡蛎消化腺匀浆等复杂基质中。结果表明，无论环境样品还是食品样品背景，平台均能实现随浓度升高而增强的荧光响应，并保持1 copy/μL检测灵敏度。考虑到既往报道中牡蛎消化腺中的诺如病毒水平通常高于该阈值，这意味着该方法在实际食品监测中具备覆盖常见污染水平的能力。与这部分内容相关的主图，既展示了复杂基质中的加标检测，也展示了真实牡蛎样品的验证结果。

图3. lpRPA-Cas平台在真实样品中的应用。（A）环境和食品样品中诺如病毒检测流程。（B-D）在自来水（B）、生菜基质（C）和牡蛎基质（D）中加入不同浓度诺如病毒RNA后的检测结果。（E）牡蛎消化腺及其匀浆照片。（F）lpRPA-Cas平台与RT-qPCR检测9份牡蛎样品时的性能比较，其中包括6份阳性和3份阴性样品。（G）lpRPA-Cas平台与RT-qPCR结果一致性的维恩图。

在真实样品验证中，本研究进一步分析了9份市售牡蛎样品，其中RT-qPCR确认6份为阳性、3份为阴性。lpRPA-Cas平台对6份阳性样品均给出了明显信号，对3份阴性样品则未见异常增强，整体判读与RT-qPCR完全一致。值得注意的是，即便是Ct值高于35的低丰度样品，也依然能够被该平台检出，说明其对低载量目标具有较强响应能力。这一结果使平台从“可在标准体系中工作”进一步走向“可在真实样品中可靠工作”。

除纸芯片本身外，本研究还构建了配套的智能手机便携检测装置，以增强现场使用完整性。该装置集成了加热垫、450 nm LED激发光源、525 nm带通滤光片、观察窗口、可充电电池和手机成像模块，整体尺寸约90 mm×60 mm×50 mm，可维持37 ℃反应环境，并直接利用手机拍摄纸芯片荧光图像。文中主图显示，这套便携设备对不同浓度诺如病毒RNA同样可达到1 copy/μL检测灵敏度，且其荧光结果与实验室台式荧光成像系统之间具有良好线性一致性。

图4. 便携式检测装置的性能分析。（A）智能手机辅助便携装置示意图。（B）便携装置实物照片。（C）便携装置检测不同浓度诺如病毒RNA时的荧光强度结果。（D）便携装置与实验室设备测得荧光强度之间的线性关系。（E）便携装置对9份牡蛎样品的荧光检测结果。

从应用层面看，这套便携系统的成本和可操作性同样具有现实意义。作者给出的整机组装成本约为45美元，明显低于常规商业荧光检测系统；单次充电可连续工作约8 h，关键部件如加热垫和LED可使用1-2年，电池寿命可达3-5年。跨设备评估中，不同手机型号之间的结果重复性也较稳定，阳性芯片和阴性芯片的相对标准偏差分别为2.18%和8.33%，均低于10%。这些数据说明，该平台不仅在分析性能上成立，也在部署成本、读出一致性和用户友好性方面具备向基层和现场场景延伸的条件。

总体来看，本研究构建了一条较完整的诺如病毒现场检测路径：以前处理后获得的RNA为输入，以冻干纸芯片为反应载体，以RT-RPA和CRISPR/Cas12a为双重信号放大与识别核心，再以智能手机完成最终荧光读出。该体系在45 min内即可完成检测，检出限达到1 copy/μL，兼具较高选择性、8周室温稳定性、复杂基质适用性以及真实牡蛎样品中的良好一致性。对于食品安全监测、环境样品筛查和资源受限条件下的快速预警而言，这一平台提供了一种兼顾灵敏度、便携性和可推广性的解决方案。

论文来源：https://doi.org/10.1016/j.cej.2026.172832