不只是抗菌：ROS响应自组装纳米纤维水凝胶困菌+入胞杀菌，缓解沙门氏菌肠炎

鼠伤寒沙门氏菌（S. Typhimurium）可侵入肠上皮细胞及巨噬细胞形成胞内寄生储库，引发急性/持续性肠炎。传统抗生素膜通透性差，难以达到有效胞内杀菌浓度且易诱导耐药、破坏共生菌群，临床亟需具胞内渗透能力与感染靶向性的新策略。抗菌肽（AMPs）因广谱杀菌、不易耐药及免疫调节受关注，但存在体内酶解快、无靶向性、胞内穿透不足及胃环境不稳定等转化瓶颈。感染部位ROS显著升高可作为刺激响应开关；ROS触发AMP自组装形成纳米纤维不仅能物理包埋细菌（模拟肠道α-防御素HD6），还可通过疏水域与膜作用杀菌，同时清除过量ROS减轻氧化应激。

小分子多元醇丙二醇（PG）具临床公认安全性，可扰乱脂质排列增强膜通透性，有望辅助AMP入胞杀胞内菌。口服水凝胶尤其是羟丙甲纤维素（HPMC）可提供酶保护、延长肠滞留及控释，但复杂合成与毒交联剂受限。本研究设计AMP Z(WK)₂，利用感染部位ROS诱导其二硫键形成及π-π堆积自组装为纳米纤维网捕获菌，结合PG促胞内穿透，HPMC简单物理包合制H@Z-P水凝胶，系统评价理化/ROS响应、包埋/杀菌/入胞活性、口服递送性能、生物安全性及小鼠沙门氏菌肠炎防治效果。

图1. AMP Z(WK)₂的自组装机制与表征

ANS荧光、TEM及流变学证实H₂O₂（模拟感染ROS）促使Z(WK)₂ Cys残基形成分子间二硫键、Trp吲哚环π-π堆积及氢键增强，临界聚集浓度（CAC）由2.63 mg/mL降至0.07 mg/mL，短棒聚集体重构为直径约10 nm有序纳米纤维互联网络，G'升高。UV-Vis出现300→350 nm红移，FTIR于516 cm⁻¹出现S-S峰增强、3277 cm⁻¹ N-H/O-H峰拓宽，CD提示以β-折叠为主。炎症相关H₂O₂浓度（0-100 μM）呈浓度依赖促纤维伸长；感染小鼠肠道注射Z(WK)₂后SEM可见丰富纳米纤维网，未感染鼠无，证实体内ROS足触发自组装。Caco-2细胞DCFH-DA染色示Z(WK)₂降H₂O₂诱导ROS，具抗氧化能力。

图2. Z(WK)₂纳米纤维网的细菌包留与胞外/胞内抗菌活性

凝集实验显示H₂O₂预处理的Z(WK)₂纳米纤维与S. Typhimurium共孵育2 h，随肽浓度升高细菌捕获沉降效率增加，近CAC浓度（64 μg/mL）时凝集指数>97%，上清活菌计数剧减。SEM见小鼠回肠腔内纳米纤维缠绕包裹沙门氏菌。该物理包埋与膜破坏杀菌协同，浓度依赖性包留为后续体内剂量提供依据，模拟先天免疫HD6纳米网机制，限制病原菌易位。Z(WK)₂联合8% PG（Z-PG）使S. TyphimuriumMIC由32降至8 μg/mL；Live/Dead染色及SEM/TEM示Z-PG致菌膜大孔、胞质渗漏，膜去极化（DiSC3(5)）与外膜透化（NPN）强于单肽。HeLa细胞感染红色荧光S. Typhimurium后，FITC-Z-PG入胞共定位且显著降胞内CFU，游离Z(WK)₂及卡那霉素无效；8% PG时胞内杀菌率>95%。证实PG两亲性增膜流动性助肽入胞，突破胞内菌庇护。

图3.H@Z-P水凝胶递送系统制备与表征

经六种凝胶筛选HPMC最优保留肽二级结构/活性。Z(WK)₂+PG+4% HPMC一步混匀得H@Z-P，可注射过0.45 mm针头。SEM示HPMC多孔→H@Z-P孔径缩小(3.24±1.09 μm)均一3D网络；FTIR氢键峰红移证强分子间氢键。流变G'>G"、自愈合（高低应变循环恢复）、猪皮及各基材强黏附，弯折/水冲不脱落。HPMC–PG–肽动态氢键给延展性、自愈及湿态肠黏附，利于口服后肠壁滞留与屏障保护

图4. H@Z-P肠道递送性能及对鼠伤寒沙门氏菌肠炎的治疗效果

H@Z-P溶胀温和（峰值~130%/2 d），15天缓慢降解不断链崩解，避肠梗阻又延滞留。pH 2.5（胃）3 h释放<10%防早释，pH 6.0/7.4（肠）持续释放10–15天。胰蛋白酶/糜蛋白酶/胃蛋白酶处理后H@Z-P抗菌活性保留（木瓜蛋白酶除外），裸肽失活，证酶保护。小鼠灌胃FITC示24 h肠荧光强度2倍于游离肽，无其他脏器分布；肠段SEM见大量纳米纤维黏附肠壁，确证延长肠滞留与感染区靶向递送。攻菌前H@Z-P预处理防体重下降、维持粪便干湿比，粪便及结肠荷菌降>3-log，防结肠缩短。H&E示对照组广泛炎性浸润绒毛破损，H@Z-P组接近正常。ROS探针染色示感染肠组织高ROS被H@Z-P削减。整体印证H@Z-P经菌清除、抗炎、抗氧化三重缓解感染性肠炎症状。

图5. H@Z-P对肠屏障与全身播散的保护

AB-PAS及IHC示H@Z-P恢复感染致MUC2↓及杯状细胞减少；维持ZO-1紧密连接表达防屏障受损。肝/脾荷菌显著减少，防肝脾肿大及组织炎性浸润；降血清ALT/AST/TBA，抑IL-1β/IL-6/TNF-α，升SOD/T-AOC、降MDA/MPO改氧化失衡。证口服H@Z-P阻菌全身播散、调全身炎症/氧化应激，系统保护。

本研究成功构建ROS响应自组装抗菌肽Z(WK)₂与PG共载HPMC水凝胶（H@Z-P）。感染部位高ROS触发Z(WK)₂经二硫键/π-π堆积/H‑键自组装为~10 nm纳米纤维网，物理包埋S. Typhimurium并协同膜破坏杀菌；PG增膜流动助肽入宿主细胞杀灭胞内寄生菌（>95%）。HPMC物理交联网络赋予胃酶抗降解、肠黏附滞留>24 h及pH依赖缓释。口服H@Z-P在小鼠沙门氏菌肠炎模型中显著降低肠道/肝脾菌荷（~3-log）、维护MUC2/ZO-1屏障、抑制全身炎症因子与氧化应激、减轻结肠缩短与组织损伤，且具优良体内外生物相容性。该"微环境触发自组装+透膜增效+口服靶向递送"一体化策略为胞内耐药菌致肠道感染提供了具转化潜力的新型抗菌肽制剂范式。

       原文链接：https://doi.org/10.1016/j.cej.2025.169392