一锅法RPA-CRISPR/Cas12a集成双模式电化学侧向层析试纸用于沙门氏菌超灵敏精准检测

1.引言

食源性细菌污染是全球公共卫生领域的重要风险，其中沙门氏菌因环境耐受性强、繁殖速度快，已成为常见食源性疾病病原体之一。传统培养计数、PCR、qPCR及免疫分析虽然能够用于沙门氏菌检测，但普遍存在耗时较长、依赖昂贵仪器或专业人员等问题。CRISPR/Cas12a具有高特异性和可编程识别优势，但直接检测灵敏度有限，通常需要与核酸扩增结合；同时，传统RPA-CRISPR两步反应存在开盖操作复杂和气溶胶污染风险。此外，普通侧向层析试纸多依赖肉眼定性判读，灵敏度和定量能力不足，因此亟需构建兼具高灵敏度、简便性与现场定量能力的新型检测平台。

本研究开发了一锅法RPA-CRISPR/Cas12a集成电化学侧向层析试纸（OPRCC-eLFS），通过高效引物设计并优化RPA与Cas12a反应组分，实现两种反应在同一体系中的动态平衡。优化后体系采用1.2 μM正反向引物、10 mM乙酸镁、0.16 μM crRNA和0.04 μM Cas12a，在41℃反应90分钟。Cas12a切割FITC-ssDNA-Bio双标探针后改变T线AuNPs捕获量；同时将丝网印刷碳电极嵌入试纸，并使工作电极与T线对准，利用AuNPs催化氨硼烷还原Fe³⁺为Fe²⁺的反应放大电流信号，从而实现10分钟肉眼筛查及追加2分钟电化学定量检测。

2.结果与讨论

OPRCC-eLFS检测原理与双模式信号输出：通过优化RPA与CRISPR/Cas12a反应平衡，使靶标沙门氏菌DNA在单管内完成等温扩增和Cas12a反式切割；切割FITC-ssDNA-Bio探针后改变T线AuNPs富集量，并利用AuNPs同时作为显色标签和Fe³⁺/AB氧化还原催化标签，实现肉眼定性筛查与原位电化学定量分析。

图 1 OPRCC-eLFS检测沙门氏菌的原理示意图：(A) RPA扩增沙门氏菌靶DNA并形成双链扩增产物，crRNA引导Cas12a识别PAM邻近靶序列，激活反式切割并裂解FITC-ssDNA-Bio信号探针。(B) 一锅法反应产物加入eLFS后，AuNPs-FITC抗体复合物随液流迁移；SPCE嵌入NC膜与背衬板之间，工作电极与T线对准。阴性样本中完整双标探针被T线链霉亲和素捕获并富集AuNPs，AuNPs催化AB还原Fe³⁺产生较高电流；阳性样本中探针被Cas12a切割，T线AuNPs减少，颜色变浅且电流降低。(C) 由此形成比色与电化学两种互补输出模式。

Fe³⁺/AuNPs/AB催化氧化还原体系的机制验证：利用紫外-可见吸收光谱、计时电流法和循环伏安法验证AuNPs对AB还原Fe³⁺过程的催化作用，确认三组分共存是高效氧化还原反应发生的必要条件，并发现电流响应随AuNPs浓度增加而增强；比较多种还原剂后确定氨硼烷具有最佳稳定性和还原性能，为T线原位电化学定量建立信号放大基础。

图 2 Fe³⁺/AuNPs/AB氧化还原体系的可行性验证：(A) AuNPs催化AB将Fe³⁺还原为Fe²⁺的反应原理。(B) UV/Vis光谱显示，仅Fe³⁺、AB和AuNPs三者共存时，Fe³⁺在420 nm处的特征吸收峰明显消失，同时AuNPs约520 nm吸收峰降低并红移，说明催化还原伴随AuNPs聚集。(C) +0.3 V下的计时电流结果表明，加入AuNPs后产生显著电流响应；(D) 循环伏安分析得到一致结论。(E) 电流信号与AuNPs用量呈正相关，支持T线AuNPs富集量的定量分析；(F) 对不同还原剂比较发现AB的催化还原响应最强且最稳定。

一锅法反应可行性与关键参数优化：通过荧光分析、试纸显色和原位电化学测试验证RPA扩增与Cas12a特异性切割能够在同一管内协同运行，靶标存在时荧光显著增强，而T线颜色和电流同步下降。进一步系统优化乙酸镁、引物、crRNA、Cas12a、反应温度与时间，确定10 mM乙酸镁、1.2 μM引物、0.16 μM crRNA、0.04 μM Cas12a及41℃反应90分钟为最佳条件。

图 3 OPRCC-eLFS方法的可行性分析：(A) 一锅法RPA-CRISPR/Cas12a反应机制示意。(B) 荧光实验显示，只有同时具备靶标DNA、引物、模板、Cas12a、crRNA和信号探针的完整体系产生强荧光，证明RPA扩增与Cas12a反式切割可在单管内有效耦合。(C) eLFS检测示意；(D) 阳性沙门氏菌样本的T线显色明显减弱，而缺少关键反应组分的对照组与阴性组保持较强T线。(E) 原位计时电流曲线同样显示完整阳性体系电流显著降低；(F) 电流定量柱状图进一步证实该差异。补充优化结果还确定双标探针浓度10 nM、反应产物上样量1.5 μL可获得最佳综合色与电化学信号。

OPRCC-eLFS的灵敏度、特异性与稳定性评估：利用不同浓度沙门氏菌验证双模式检测性能，T线颜色和电流均随菌浓度升高而降低，电化学信号与菌浓度对数满足Y=3.423−0.464X（R²=0.985），视觉检测限为38.4 CFU/mL，电化学检测限低至1.96 CFU/mL。对多种非靶病原菌及不同沙门氏菌血清型的测试表明方法具有良好选择性，且重复性、30天储存稳定性和批间一致性均保持在可接受范围。

图 4 OPRCC-eLFS检测沙门氏菌的分析性能：(A) 沙门氏菌浓度由3.84增至3.84×10⁷ CFU/mL时，eLFS T线逐渐变浅，可用于快速比色筛查。(B) 对相应试纸T线进行原位计时电流测量，电流信号随菌浓度增加而持续下降。(C) T线电流与沙门氏菌浓度对数呈良好线性关系，回归方程为Y=3.423−0.464X，R²=0.985。(D) 选择性实验中，阪崎克罗诺杆菌、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌、铜绿假单胞菌、单核细胞增生李斯特菌和大肠杆菌即使浓度高达10⁶ CFU/mL，也未引起明显T线变化；含10⁴ CFU/mL沙门氏菌的混合样本以及4种不同沙门氏菌血清型均表现出明显阳性响应。(E) 电化学定量结果与比色结果一致。方法10次重复测定RSD为6.42%，储存30天电流RSD为9.49%，批间RSD为9.02%。

复杂食品样本中的加标检测与实际应用验证：在牛奶、橙汁、鸡蛋和三文鱼四种食品基质中构建沙门氏菌加标样本，采用OPRCC-eLFS完成比色筛查与电化学定量。四类基质的视觉检测限均为384 CFU/mL；牛奶中的电化学检测限为3.84 CFU/mL，橙汁、鸡蛋和三文鱼中的电化学检测限为38.4 CFU/mL，且结果与商业实时PCR试剂盒高度一致，证实该平台能够适应不同食品基质并满足现场快速检测需求。

图 5 OPRCC-eLFS在真实食品样本中的沙门氏菌检测：(A、B) 牛奶样本的双模式检测结果及T线电化学信号与沙门氏菌浓度的线性关系；(C、D) 橙汁样本的检测结果与对应回归关系；(E、F) 鸡蛋样本的检测结果与对应回归关系；(G、H) 三文鱼样本的检测结果与对应回归关系。不同基质中，T线颜色和电流均随沙门氏菌浓度增加而降低。四种食品的视觉检测限均达到384 CFU/mL；牛奶电化学检测限为3.84 CFU/mL，橙汁、鸡蛋和三文鱼为38.4 CFU/mL。不同基质间检测限差异主要与食品基质效应有关，商业实时PCR验证结果与OPRCC-eLFS高度一致。

3.总结

本文构建的OPRCC-eLFS平台将一锅法RPA-CRISPR/Cas12a与电化学侧向层析试纸有机结合，通过平衡核酸扩增与Cas12a切割过程，减少传统两步反应的开盖操作和气溶胶污染风险。其核心优势在于利用AuNPs同时承担显色标签与氧化还原催化标签，使同一试纸兼具肉眼快速筛查和高灵敏度电化学定量能力，并通过双模式结果相互校准提升检测可信度。该方法对非靶菌具有良好选择性，在多种食品基质中表现出稳定、重复和可靠的检测性能，具有操作简便、设备小型化潜力强和适用于现场监测等特点，为沙门氏菌及其他食源性病原体的快速连续监控提供了具有推广价值的技术方案。

论文链接：https://doi.org/10.1016/j.bios.2025.117529