明胶“闸门”识别金黄色葡萄球菌：少量样本读出细菌数量与抗菌药物敏感性

设计原理

致病菌快速检测和药敏分析是食品安全、环境监测及感染控制中的重要需求，但传统培养法和肉汤微量稀释法耗时较长，PCR、质谱等方法又依赖复杂仪器和专业操作。该研究以金黄色葡萄球菌可分泌明胶酶这一生物学特征为基础，构建了微孔膜聚合物门控（MPG）生物传感器。其核心思路是：明胶溶液通过微孔膜时，明胶分子会在膜表面累积并部分堵塞孔道，使流动时间延长；当金黄色葡萄球菌分泌的明胶酶水解明胶后，膜孔堵塞减弱，流动时间随之缩短。因此，金黄色葡萄球菌的存在、细菌浓度变化以及抗生素抑菌效果，均可被转换为可量化的流动时间信号（图 1）。

图1  MPG生物传感器用于金黄色葡萄球菌检测与药敏分析的原理示意图

研究内容与结果

1. 微孔膜门控效应的建立与机制验证

研究首先验证明胶能否在微孔膜上产生稳定的“门控”效应。结果显示，PBS 溶液通过膜所需时间约为 10 s，而 5 mg/mL 明胶溶液的流动时间增加至约 18 s；随着明胶浓度由 0 增加至 30 mg/mL，流动时间呈浓度依赖性延长（图 2）。这说明明胶分子能够有效改变溶液通过微孔膜的速度，并使明胶浓度差异转化为时间信号。进一步的微观表征显示，明胶溶液通过后，膜表面可见孔道数量明显减少，提示明胶在膜上累积并造成部分堵塞；荧光标记明胶实验也证明明胶确实被截留于膜结构中（图 2）。因此，该平台的信号来源不只是单纯的黏度变化，而是“明胶累积—膜孔阻塞—流动时间延长”的综合效应。

图2  MPG生物传感器的实验系统构建及明胶介导的微孔膜门控机制验证

2. 明胶酶响应是细菌检测的关键中间环节

在明确明胶门控机制后，作者进一步验证该体系对明胶酶的响应能力。25 mg/mL 明胶溶液的流动时间约为 45.5 s，而加入 0.2 mg/mL 明胶酶后，流动时间降至约 12.3 s，接近 PBS 水平（图 3）。这说明明胶酶能够水解明胶，使其分子链变短、黏度下降、堵膜能力减弱，从而显著缩短流动时间。传统明胶液化实验和流变学结果也支持这一机制：经明胶酶处理后，明胶由凝胶状态转变为溶胶状态，溶液黏度明显降低（图 3）。在检测性能方面，明胶酶与明胶反应 30 min 后流动时间趋于稳定；在 10⁻⁵–10⁻² mg/mL 范围内，流动时间与明胶酶浓度的负对数呈良好线性关系，R² 为 0.992（图 3）。这一步证明，MPG 传感器能够把明胶酶活性转化为稳定、可量化的流动时间变化，为后续检测金黄色葡萄球菌奠定基础。

图3  MPG生物传感器对明胶酶的响应性能与选择性验证

3. 金黄色葡萄球菌检测：从酶活性转向细菌定量

基于金黄色葡萄球菌生长过程中可分泌明胶酶，作者将该平台用于细菌检测。加入金黄色葡萄球菌后，明胶溶液的流动时间明显下降，说明细菌分泌的明胶酶能够水解明胶并削弱膜孔堵塞效应（图 4）。随着孵育时间延长，较低浓度细菌也能产生可检测信号；培养 8 h 后，低至 1 CFU/mL 的金黄色葡萄球菌即可引起显著流动时间变化，显示出较高检测灵敏度（图 4）。选择性实验显示，金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌均能显著降低流动时间，而表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌和大肠杆菌影响不明显（图 4）。这表明该方法并非简单响应所有细菌，而是主要依赖金黄色葡萄球菌及 MRSA 相关明胶酶活性引发的明胶水解过程，对金黄色葡萄球菌具有较好的识别能力。

图4  MPG生物传感器用于金黄色葡萄球菌检测的性能评价

4. 真实样本验证：从模型体系走向实际应用

为了验证实际应用潜力，研究进一步在人尿液、橙汁和湖水中进行加标检测。结果显示，这些真实样本本身对流动时间影响较小，提示样本基质不会明显干扰明胶门控过程。不同浓度金黄色葡萄球菌加入真实样本后，流动时间随细菌浓度和孵育时间发生规律性变化：高浓度样本在较短孵育时间内即可被识别，低浓度样本则需要更长孵育时间获得明显信号（图 5）。研究还开发了 Android 手机应用“Data Analyzer”，可将流动时间换算为细菌浓度，提高了检测结果读取和现场应用的便利性（图 5）。真实样本检测的回收率为 91.2%–114.0%，相对标准偏差小于 8.8%；与平板计数法相比，MPG 方法测定结果与平板计数结果的相对比值范围为 88.6%–111.8%，说明该方法在复杂样本中仍具有较好的准确性和可靠性。

图5  MPG生物传感器在真实样本中检测金黄色葡萄球菌的应用验证

5. 药敏分析：用流动时间反映抗生素抑菌效果

该研究进一步将 MPG 平台拓展至抗生素药敏分析。其判断逻辑是：若抗生素能够有效抑制金黄色葡萄球菌生长，明胶酶产生减少，明胶水解减弱，微孔膜堵塞增强，流动时间升高；若抗生素抑制作用不足，细菌继续分泌明胶酶，明胶仍被水解，流动时间保持较低水平。实验中，金黄色葡萄球菌单独存在时，明胶溶液流动时间约为 23.5 s；加入羧苄青霉素后，流动时间升至约 45 s，提示细菌生长和明胶酶产生被抑制（图 6）。随着抗生素浓度升高，流动时间逐渐增加，说明抑菌作用增强；活/死菌染色也显示，羧苄青霉素浓度升高后活菌信号逐渐减弱，并在 4 μg/mL 时基本消失（图 6）。根据流动时间不再明显变化并进入平台期的最低抗生素浓度，作者测得卡那霉素、多黏菌素 B、万古霉素、阿奇霉素和羧苄青霉素的 MIC 分别为 0.062、2、0.5、0.25 和 2 μg/mL；这些结果与传统肉汤微量稀释法一致，而检测时间缩短至约 6 h（图 6）。

图6  MPG生物传感器用于金黄色葡萄球菌抗菌药物敏感性测试

结论

该研究构建了一种基于“明胶酶水解明胶—微孔膜堵塞变化—流动时间读数”的 MPG 生物传感器，实现了金黄色葡萄球菌检测和药敏分析的一体化。其创新性在于将传统明胶液化反应转化为可定量、低成本、具备便携应用潜力的时间信号，并在真实样本和 MIC 测定中验证了可靠性。局限性在于，超高灵敏检测仍需 4–8 h 培养，并需后续约 30 min 的酶响应检测；药敏 MIC 判定依赖流动时间平台期识别，原文未给出平台期判定的明确数学阈值，且现阶段仍需外部负压驱动，后续需进一步缩短检测时间并推进装置小型化。

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.bios.2026.118732