基于CRISPR技术的类鼻疽伯克霍尔德菌环境检测揭示了泰国东北部的卫生漏洞与类鼻疽病风险

1.引言

类鼻疽病是一种由类鼻疽伯克霍尔德菌引起的高致死率热带传染病，其病原体广泛存在于东南亚地区的环境水体中。然而，受限于传统培养法灵敏度低、耗时长等技术瓶颈，环境中的病原体监测一直面临巨大挑战，导致无法准确评估环境暴露与人类感染风险之间的关联。这种监测能力的缺失，使得在泰国东北部等资源有限的流行区，难以精准识别卫生漏洞并实施有效的疾病防控，迫切需要一种高灵敏度、快速且便携的新型检测手段。

本研究开发了DNAzyme驱动的滚环扩增/分子信标编码系统（DRM-ES），通过耦合智能手机卷积神经网络（CNN）的方法，解决了传统技术难以对多种活细菌进行高通量、高灵敏度同时检测的问题。在实验方法上，该研究利用特异性RCD识别活菌并启动滚环扩增，产生长单链DNA作为支架，进而杂交不同荧光标记的分子信标以实现多重编码。随后，利用智能手机采集荧光信号，并借助深度学习算法对图像进行自动分析与分类，实现了对复杂样本中多种病原菌的精准识别与定量。

2.结果与讨论

CRISPR-BEEPs检测靶点的生物信息学筛选与验证：利用全球宏基因组组装基因组（MAGs）和B. pseudomallei参考基因组数据库，结合序列比对分析评估TTS1、BPSS1386及CRISPR-BP34三个候选靶点的环境特异性与种内保守性，优化筛选出在环境微生物中无匹配序列且在B. pseudomallei中保守性高达99.76%的CRISPR-BP34靶点，解决了复杂环境背景下高特异性检测的难题，为开发精准的环境监测方法奠定了理论基础。

图 1 aDNA靶标包括两套qPCR引物（TTS1和BPSS1386）以及CRISPR-BP34位点（RPA引物和crBP34），它们位于基因组的不同区域，便于独立检测。b来自热带和亚热带地区的27,771个宏基因组的数据可用性，涵盖了土壤、淡水、废水、粪便、真菌和植物等来源的微生物群落。展示了排名前86位的分类目。c在（b）中发现的环境宏基因组的分类丰度，以及这些分类群与（a). d全球范围内DNA靶标的保守性B. 类鼻疽伯克霍尔德菌种群，基于3341个高质量基因组组装。b、c MAG按来源进行颜色编码。c, d匹配状态以灰度渐变图示：黑色表示完全匹配，灰色表示部分不匹配，白色表示无匹配。

CRISPR-BEEPs检测平台的性能评估与优化： 利用qPCR和CRISPR-BP34试纸条对比分析混合DNA样本的检测限，结合不同水源（管道水、井水、自然水体）的实地采样模拟，优化了针对大肠杆菌-proxy（E. coli-Bp）的过滤富集、裂解及培养条件（如LB肉汤培养6h、氯处理灭活验证），确立了CRISPR-BEEPs在复杂环境水体中优于传统qPCR的高灵敏度检测能力，实现了对类鼻疽伯克霍尔德菌痕量DNA的快速可视化识别。

图 2 （a, b） 使用TSS1和BPSS1386的qPCR检测（a），以及采用侧向流动层析读出的CRISPR-BP34系统（b）在混合物种DNA中的分析灵敏度。每个检测均进行三次技术重复。Ct值采用颜色编码：绿色=无扩增，红色梯度=信号强度增加（深红=Ct值低，浅红=Ct值高）。黑色三角形指示三次重复均能稳定检测到的最低浓度。（c） 检测方法检出限（基因组拷贝数/µL）与文献报道的环境水样中类鼻疽伯克霍尔德菌（B. pseudomallei）浓度（CFU/µL）的比较，假设基因组与CFU的比例为1:1。（d） 本研究采样的不同水体类型的示意图。（e） 利用携带crBP34 DNA靶标的大肠杆菌（E. coli-Bp）作为类鼻疽伯克霍尔德菌的替代物，在符合生物安全要求的前提下，对环境监测进行的实验室优化工作流程。将E. coli-Bp掺入磷酸盐缓冲液（PBS）中模拟自然水源。工作流程包括：（i）仅对掺菌PBS进行过滤；（ii）对掺菌PBS进行过滤后，将滤纸在肉汤中培养；（iii）对掺菌PBS进行过滤后，将滤纸在琼脂平板上培养。随后提取DNA并通过qPCR和CRISPR-BP34检测进行分析。

环境水体中病原体检测方法的优化与验证：利用大肠杆菌替代物（E. coli-Bp）模拟环境样本，结合qPCR和CRISPR-BEEPs分子检测技术评估直接滤纸法与培养富集法的灵敏度差异，优化了氯处理灭活验证及肉汤培养增菌条件（如培养6小时即可实现低浓度检出），解决了环境水样中病原体检出限高的问题，确立了“过滤-短时增菌-分子检测”的优化监测流程以替代传统耗时方法。

图 3 通过直接过滤法对E. coli-Bp进行qPCR和CRISPR-BP34检测，其接种浓度范围为0至10万CFU，这一结果与先前报道中从过滤0.5–5升环境水样所回收的B. pseudomallei预期载量相一致。过滤分别在未处理条件以及经氯消毒（5 mg/L，30分钟）后进行。每项检测均设置三个技术重复。Ct值采用颜色编码：绿色表示无扩增；红色渐变表示信号强度逐渐增强。b在未经处理和经氯处理的条件下，对滤纸进行过滤后，分别在肉汤或琼脂平板上进行培养，并采用qPCR方法进行检测。对于肉汤培养，分别于1、2、3、4、5、6及24小时取1 mL样品，以评估DNA信号随时间的变化情况。对于琼脂平板，于24小时时用10 μL无菌环接种法采集平板划线样品，用于DNA提取。每项检测均设置三个技术重复，并绘制Ct值的平均值曲线。Ct值采用与（）中相同的颜色编码。c以菌落形成单位（CFU）计数作为衡量指标，用于评估在未经处理及经氯处理条件下，经肉汤培养后从滤纸上回收的活菌数量。峰值浓度采用颜色编码（绿色，0 CFU；浅灰色至黑色，4–100,000 CFU）。在滤纸接种后的每个时间点，均取100 µL培养液进行CFU计数。数据为三次独立的生物学重复（n= 3），线条表示各重复的平均值。d基于过滤后在琼脂平板上培养并进行菌落刮取以提取DNA的、兼顾存活状态的分子检测流程示意图，与需对疑似细菌菌落进行目视检查的传统方法相比。

CRISPR-BEEPs环境水体监测的实地验证与效能评估：利用双重qPCR（TSS1/BPSS1386）作为金标准对照，结合传统培养法对比分析CRISPR-BEEPs在333份真实环境水样（涵盖管道水、池塘、河流等）中的检测性能，优化了雨季/旱季不同水文条件下的采样策略，证实了CRISPR-BEEPs在复杂环境样本中具备与传统分子诊断高度一致的特异性（p<0.001）及优于传统培养的灵敏度，确立了其作为类鼻疽伯克霍尔德菌环境监测可靠工具的实战价值。

图 4 a各采样点的代表性样本：自来水（上）、静止池塘水（中）和流动运河水（下）。b不同检测方法的检测结果比较，包括针对TSS1和BPSS1386的qPCR、联合双重qPCR分类法、常规检测以及CRISPR-BEEPs（n= 333个样本）。Ct值采用颜色编码：绿色表示无扩增；红色渐变表示信号强度逐渐增强，其中深红色代表Ct值较低，浅红色代表Ct值较高。对于双重qPCR结果：红色表示阳性，黄色表示结果不确定，蓝色表示阴性。对于CRISPR-BEEPs及常规检测：灰色表示阳性，白色表示阴性。c–e不同水源中B. pseudomallei检出的季节性变化：自来水（n= 145）、钻井水（n= 15）、池塘或湖泊（n= 129）以及运河或河流（n= 44），基于双重qPCR（c）、CRISPR-BEEPs（d）和常规检测方法（e）。 采用卡方检验评估了雨季/洪涝期与旱季之间检测结果差异的统计学显著性。所有检验均为双侧检验。

CRISPR-BEEPs检测系统的临床验证与流行病学关联分析：利用1,132名参与者（涵盖类鼻疽患者、其他细菌感染及健康对照）的队列数据，结合家庭住址与水源采样点的地理距离分布（1-10km梯度），评估了CRISPR-BP34在真实世界样本中的诊断效能，优化了从大规模人群筛查到入户采样的研究设计，证实了该检测方法在复杂临床背景下与双重qPCR结果的高度一致性（如39/39阳性吻合），并揭示了居住地 proximity 与环境暴露风险之间的潜在空间关联。

图 5 堆叠条形图展示了在研究期间入组的参与者情况：包括2020年11月至2021年11月期间进行直接水样采集的参与者，以及2019年至2020年、2021年至2023年期间居住在采样点1–10公里范围内但未进行直接水样采集的额外参与者。参与者按临床状态分组：临床确诊的类鼻疽（橙色）、其他细菌感染（蓝色）以及无类鼻疽病史的健康对照者（绿色）。3–5公里半径对应村民从事农业活动时的典型出行距离，而10公里则大致相当于相邻村庄之间的距离。b按检测方法类型对队列中家庭用水样本中B. pseudomallei的检出情况。对于拥有多个水样的家庭，只要至少有一份样本呈阳性，即判定该家庭为阳性。

类鼻疽环境暴露风险的空间流行病学分析与多方法验证：利用GIS地理信息系统绘制研究区域人口密度与采样点分布图，结合线性回归分析证实行政区人口数量与水样采集量呈显著正相关（R²=0.58），并通过森林图模型评估了不同检测方法（双重qPCR、CRISPR-BEEPs及传统培养法）下患者特征、合并症、职业（农业/渔业）及环境暴露（洪水、水体阳性率）与类鼻疽发病风险的关联，优化了从宏观地理分布到微观个体风险因素的流行病学调查策略，确立了环境水体中伯克霍尔德菌阳性率作为预测人类感染风险的关键独立危险因素。

图 6 泰国东北部乌汶府的地图，该府是1135名研究参与者中1012人的居住地，图中突出了当地的水系与地形。通过线性回归估计的采集水样数量与区级人口密度之间的正相关关系。研究参与者的家庭所在地，包括那些采集了直接水样者以及虽未采样但居住在附近者。cc队列中各参试家庭之间的平均距离（单位：公里）。d经多变量逻辑回归调整后的优势比，用于显示环境检测与eB. 之间的关联。类鼻疽伯克霍尔德菌在水源中的检出与类鼻疽发病风险。圆点表示优势比，误差线代表95%置信区间。位于参与者家庭10公里范围内的水样中检测到之间的关联。类鼻疽伯克霍尔德菌的阳性结果被用作邻近环境存在情况的空间代理指标。该分析纳入了类鼻疽病例（n= 395）和非类鼻疽对照组（n= 634），后者包括患有其他细菌感染的个体，以及居住在同一流行区但从未罹患类鼻疽的健康人群。统计学显著性因检测方法而异。检测方法包括双重qPCR（针对两个DNA靶标，每个样本进行两次技术重复）、CRISPR-BEEPs（针对一个DNA靶标，每个样本进行两次技术重复），以及传统的基于培养的平板检测方法（每个样本设置两块技术平板）。阳性判定标准详见“方法”部分。所有检验均为双侧检验。各地区缩写如下：本塔里克（BTR）、冬莫达英（DMD）、德乌东（DUD）、孔谦（KC）、古考蓬（KKP）、凯马拉特（KMR）、匡奈（KN）、老素奥谷（LSK）、穆昂（M）、穆昂三西普（MSS）、纳查銮（NCL）、南坤（NK）、纳坦（NT）、纳亚（NYi）、南云（NYu）、披汶芒沙汉（PBM）、坡赛（PS）、萨蒙（SR）、萨旺维拉翁（SWW）、西林通（SRD）、西姆央迈（SMM）、德拉坎普特蓬（TPP）、丹苏姆（TS）、通西乌东（TSU）、瓦林查拉普（WRC）。

3.总结

本文的优势在于构建并验证了一套从实验室优化到实地应用的全链条类鼻疽环境监测体系。研究创新性地利用CRISPR-BEEPs技术结合双重qPCR，显著提升了环境水样中病原体的检测灵敏度与特异性，并通过替代菌株优化了符合生物安全要求的富集流程。此外，文章通过大规模人群队列与地理空间分析，成功将分子检测结果与流行病学风险因素（如职业暴露、水体阳性率）相关联，证实了该方法在真实世界复杂环境中的实战价值，为类鼻疽的精准防控提供了科学依据。

论文链接： https://doi.org/10.1038/s41467-026-73286-8