Food Chemistry：刺激响应DNA水凝胶联用聚A-AuNPs，实现大肠杆菌O157:H7双模式高灵敏检测

大肠杆菌O157:H7因感染剂量低、致病性强，一直是食品安全监测中的重点对象。传统菌落计数、PCR和ELISA虽然各有优势，但往往存在耗时较长、对仪器依赖较高或不利于现场快速筛查等限制。尤其在复杂食品基质中，单一信号输出的传感方法容易受到环境波动、样品背景和操作差异干扰，导致结果稳定性不足。本研究正是在这一背景下，尝试把刺激响应DNA水凝胶、适配体识别以及比色和荧光双信号输出整合到一个统一平台中，使其既能满足现场初筛，又兼顾后续高灵敏定量分析。

本研究设计的核心在于一个具有多重功能的适配体交联链：其一端带有FAM荧光基团，另一端带有聚A10序列，中间则是针对大肠杆菌O157:H7的特异性适配体。研究者先利用带有丙烯酸修饰的短链DNA与丙烯酰胺共聚，得到DNA功能化线性聚合物，再通过适配体交联链把不同聚合物连接起来，形成三维聚丙烯酰胺/DNA杂化水凝胶。按照方案1所示原理，在没有目标菌时，水凝胶结构保持稳定；一旦目标菌出现，适配体会优先与细菌结合并从凝胶网络中脱离，从而触发凝胶解体，并同时释放带有FAM和聚A10标签的信号链。被释放的聚A10链可吸附到AuNPs表面，阻止高盐条件下的聚集，从而产生比色信号；释放到上清液中的FAM信号链则带来同步增强的荧光输出。

图1. 刺激响应DNA水凝胶的构建及其双模式检测机理示意图。（a）SA、SB与适配体交联链通过杂交自组装形成三维刺激响应DNA水凝胶；（b）目标菌触发水凝胶解体后的比色/荧光双模式检测机制，包括适配体识别与释放、聚A10-AuNPs保护过程以及荧光信号产生。

从材料基础看，这一水凝胶并不是简单依赖DNA链之间的物理缠结，而是通过聚丙烯酰胺骨架与DNA杂交共同形成化学-物理复合交联网络，因此在结构稳定性和信号可控释放方面具有明显优势。研究显示，制备得到的水凝胶在白光下呈半透明均一状态，在紫外激发下表现出均匀绿色荧光，说明功能化适配体交联链已经成功嵌入凝胶网络。扫描电镜进一步显示其具有典型三维多孔结构，有利于目标菌扩散进入并加快识别响应。流变结果表明，水凝胶储能模量始终高于损耗模量，平台模量接近40 Pa，明显高于仅依赖物理交联的传统DNA水凝胶，说明其机械强度和结构稳定性更强，也为复杂食品样品中的抗干扰应用打下了基础。

在机理验证方面，本研究通过电泳、圆二色谱以及比色/荧光响应共同证明了“识别-解体-释信号”这一核心路径。PAGE结果显示，适配体交联链能够与两条DNA链形成稳定三链复合物，而在加入不同浓度的大肠杆菌O157:H7后，该复合物会发生浓度依赖性解离。圆二色谱也显示，原本形成的有序DNA螺旋结构在目标菌存在时被破坏，提示适配体确实因与细菌结合而从原有网络中释放。与此对应，比色检测中，实验组上清液能够有效保护AuNPs免于盐诱导聚集，使溶液保持红色，A520/A650比值达到6.13，显著高于空白组的1.52；荧光检测中，实验组上清液的荧光强度约为空白组的9.6倍，说明目标菌触发后，两条信号通路能够同步开启。

图2. 传感机理验证。（a）12%非变性PAGE分析：M为25-500 bp DNA Marker；1-3泳道分别为SA、SB及其混合物；4泳道为适配体交联链；5泳道为SA+SB+适配体杂交复合物；6-7泳道分别为高、低浓度大肠杆菌O157:H7存在时复合物的解离情况。（b）圆二色谱分析。（c）实验组与对照组的比色结果及对应A520/A650比值比较。（d）实验组与对照组AuNPs的紫外-可见吸收光谱。（e）检测前后实验组与对照组在紫外照射下的荧光分布及上清液荧光强度比较。（f）实验组与对照组上清液的荧光发射光谱。

 在检测条件优化后，这一双模式体系表现出较宽的线性范围和明显分工。对于比色通道而言，随着目标菌浓度从10^3升高到10^9 CFU/mL，AuNPs溶液由蓝灰色逐步转为红色，肉眼可直接区分至10^5 CFU/mL，适合现场快速初筛。进一步用紫外-可见光谱分析发现，A520/A650与菌浓度对数在10^3-10^9 CFU/mL范围内呈良好线性关系，R²=0.992，检测限为97 CFU/mL。荧光通道则表现出更高灵敏度：520 nm处荧光强度随菌浓度上升而稳定增强，在跨越6个数量级的范围内与菌浓度对数保持优良线性，R²=0.998，检测限低至1 CFU/mL，比比色模式又提升了近两个数量级。研究者还指出，这种高灵敏荧光输出并不依赖酶催化或复杂核酸扩增，而是来自目标诱导水凝胶解体后大量FAM标记链同步释放形成的内源性信号放大效应，因此在维持结构简洁的同时获得了较高性能。

这种“单次识别、双重输出”的设计，也是本研究最突出的策略价值所在。比色模式直观、低门槛，适合快速判别；荧光模式则更适合高灵敏定量与结果确认。两条通路均由同一识别事件驱动，因此不是两个彼此分离的检测模块，而是互相印证、功能互补的统一体系。

图3. 检测性能分析。（a）不同浓度大肠杆菌O157:H7（10^3-10^9 CFU/mL）诱导的AuNPs溶液颜色梯度变化；（b）对应浓度下的紫外-可见吸收光谱；（c）A520/A650与菌浓度对数之间的关系；（d）比色检测的线性拟合曲线；（e）不同菌浓度下上清液的荧光发射光谱；（f）荧光强度随菌浓度对数变化的趋势；（g）荧光检测的线性校准曲线。

 在实际适用性评估中，本研究对特异性、重复性、稳定性和真实样品表现进行了较系统验证。无论在比色还是荧光模式下，只有大肠杆菌O157:H7在10^9 CFU/mL时产生显著信号，而金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌和副溶血弧菌等干扰菌响应均很弱；其中荧光模式下，目标组信号强度约为干扰组的8-10倍，说明适配体识别具有较高专一性。重复性方面，在10^9和10^5 CFU/mL条件下，组内重复测定RSD均低于2.0%，不同批次水凝胶间的RSD也保持在2.1%以下，说明该体系制备和响应过程都较稳定。储存稳定性方面，在4 ℃条件下放置20天后，比色和荧光信号仍可保持93%以上。真实样品验证则选用了牛奶、羊肉和鱼肉三类食品基质，在10^4、10^6和10^8 CFU/mL加标水平下，比色法回收率为97.1%-108.3%，RSD为1.1%-2.2%；荧光法回收率为95.6%-104.2%，RSD为1.2%-2.2%。这些结果说明，该体系在复杂食品基质中仍能维持较高准确性和重复性。

图4. 生物传感体系的特异性、重复性与稳定性评价。（a-b）不同菌株存在时的比色响应（A520/A650）（a）和荧光信号（b），用于表征体系特异性；（c）比色检测的组内（1-3）与组间（4-6）重复性分析；（d）荧光检测的组内（1-3）与组间（4-6）重复性分析；（e）4 ℃储存0-20天后比色信号稳定性；（f）4 ℃储存0-20天后荧光信号稳定性。

 总体来看，本研究提出的聚丙烯酰胺/DNA杂化水凝胶双模式传感体系，把适配体识别、网络结构变化和双信号输出压缩到同一动态交联单元中。它通过聚A-AuNPs比色途径实现快速现场筛查，又通过FAM荧光途径提供更高灵敏度和定量确认能力，从而建立起“先筛查、再确认”的层级检测策略。对于食品中大肠杆菌O157:H7监测而言，这种兼顾直观判读、高灵敏度和复杂基质适应性的方案具有较强实用潜力。

 论文来源：https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2026.148789