多重重组酶聚合酶扩增技术实现尿液样本中致病菌的快速灵敏检测

原创

来源：邹晶晶

2023-07-11 00:00:00

45次浏览

核心提示：细菌感染可引起严重的疾病，如肺结核、败血症、肾炎和膀胱炎。快速、灵敏的细菌检测是治疗这些疾病的先决条件。为此，清华大学邢婉丽团队基于离心式微流控芯片发展了多重RPA，以完成尿液样本中常见的5种致病菌的全流程检测（细菌DNA提取、DNA扩增及信号读出）。该方法的检测限满足临床要求，且检测时间缩短至40 min，具有较强的临床应用价值。

尿路感染(UTIs)是常见的细菌感染性疾病，每年在全球范围内影响约1.5亿人的身体健康。临床上此病的治疗通常依赖于抗菌药物的使用，但是如何选择合适的抗生素用于病患治疗仍然是医生面对的一个难题。这是由于临床上对病原的鉴定金标准仍然是耗时费力的细菌学培养，医生在给出治疗方案时没有准确的样本数据依据。为缩短诊断时间，市场上也有一些技术得到了发展，例如流式细胞术、质谱、毛细管电泳、PCR及测序，然而这些技术不仅依赖于价格昂贵的设备，还需要经过培训的专业人员，这些附加条件在很大程度上限制了它们的广泛传播与应用。基于此研究背景，清华大学邢婉丽团队基于离心式微流控发展了一个多重RPA技术，能够线上实现全流程的病原(大肠埃希氏菌、奇异变形杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌)多重检测，无需复杂繁冗的人工操作，在POCT领域内有很强的应用潜力。

在离心式微流控芯片上，作者将微珠和搅拌棒引入裂解区域，实验时通过外置的磁力搅拌器推动搅拌棒与微珠碰撞继而实现细菌的物理破碎，实现DNA的释放。在这里，通过计算细菌回收率表征了DNA的提取效率(高于60%)，也优化了磁力搅拌器的旋转速度和细菌的裂解时间(图1)。在线下验证了引物和探针特异性之后，作者线上利用101-106 CFU/mL的菌液表征了这5种病原的检测灵敏度，除了鼠伤寒沙门氏菌灵敏度稍差(103)，其余均可以达到102 CFU/mL(图2)。不过，此检测限都满足临床检测要求。最后，作者利用模拟样本表征了方法的实际应用可行性(图3)。值得一提的是，考虑到尿液样本的基质复杂性，作者引入了0.22 μM孔径便携过滤装置以进行尿路样本的前处理(图4)。

总的来说，作者创新性地提出了一个全集成多重病原检测技术，在POCT领域内具有很强的应用价值。不过，该技术的多重检测理念在于芯片上的分区检测，需要提前将引物和探针冻干于相应的反应单元内，并放置于-20 ℃冰箱内储存。从此出发，该技术的经济成本、芯片的贮存及贮存周期问题还有待进一步改善。另外，本研究尚未用到实际临床样本，这也是文章存在的一个不足。