鼠伤寒沙门氏菌非酶级联放大比色法检测

  本研究创新性地开发了一种基于非酶联信号放大的比色免疫分析法，并成功地证明了该方法对鼠伤寒沙门氏菌的检测灵敏度远高于传统的HRP的ELISA方法。AgNPs释放的Ag+离子被证实具有抑制PtNPs过氧化物酶活性的能力。搭建微流控平台，通过自主开发的Raspberry Pi自动完成所有流程，实现鼠伤寒沙门氏菌的“样品即结果”检测，大大降低了对技术人员操作技能的要求。该比色免疫法与微流控平台结合可检测低至16.8 CFU/mL的鼠伤寒沙门菌，并可进一步推广应用于其他食源性致病菌的特异性抗体检测，确保食品安全。

  纳米酶是一种基于纳米材料的人工酶，具有优异的类酶特性，由于其成本更低、更容易合成和更高的稳定性，在各种比色免疫测定中经常被用作天然酶的替代品。纳米酶与识别元件结合以标记靶标，由于类酶的特征相互作用主要发生在纳米酶的表面，一些识别元件的偶联可能会由于表面电荷和微环境的改变而屏蔽部分活性位点，从而降低催化活性。

  一些报道发现pM水平的Ag+离子可以强结合到铂纳米颗粒(PtNPs)表面，抑制其过氧化物酶样活性。此外，由于过氧化氢(H2O2)比Ag+/Ag具有更高的电化学电位，因此具有显著Ag原子堆积能力的银纳米粒子(AgNPs)可以被H2O2瞬间蚀刻，使其原子转化为离子。一个直径为65 nm的AgNP可释放约7 × 106个Ag+离子。因此，结合AgNPs释放Ag+离子和抑制PtNPs进行级联信号放大是非常有前景的。

  采用常规HRP酶联免疫吸附法对鼠伤寒沙门菌进行平行检测比较。当鼠伤寒沙门菌浓度从2 × 100 CFU/mL增加到2 × 105 CFU/mL时，氧化TMB的颜色逐渐由蓝色变为无色，表明抑制率增加。当鼠伤寒沙门菌浓度从2 × 105 CFU/mL增加到2 × 107 CFU/mL时，由于“ hook effect ”，颜色相反地变为浅蓝色，仅在2 × 102 CFU/mL ~ 2 × 104 CFU/mL范围内呈线性关系。基于3倍的信噪比，计算该免疫分析法的LOD为18 CFU/mL。常规酶联免疫吸附测定法在2 × 105 ~ 2 × 107 CFU/mL范围内呈线性关系，检出限为2.3 × 104 CFU/mL。与传统ELISA相比，该方法对鼠伤寒沙门菌的检测灵敏度提高了约3个数量级。

  在6 × 100 ~ 6 × 107 CFU/mL范围内检测鼠伤寒沙门菌，建立该免疫分析法的校准曲线。当鼠伤寒沙门菌浓度从6 × 100增加到6 × 103 CFU/mL时，着色室的蓝色越来越浅，抑制率与鼠伤寒沙门菌浓度呈良好的线性关系，其校准曲线为y = 0.0466 ln(x) + 0.0388，当浓度超过6 × 103 CFU/mL时(裸眼检出限)，颜色变为无色。根据3倍的信噪比，计算出该免疫分析法的LOD为16.8 CFU/mL。

  图1 检测示意图。

  为评价该免疫检测方法的特异性，选择浓度为1 × 105 CFU/mL的大肠杆菌O157:H7、霍乱弧菌、单核增生李斯特菌和金黄色葡萄球菌4种常见致病菌作为非靶菌，选择浓度为6 × 103 CFU/mL的鼠伤寒沙门菌作为靶菌，在该微流控平台上对所有细菌进行了免疫检测。对鼠伤寒沙门菌和所有靶菌与非靶菌混合的抑制比明显高于非靶菌。这表明所提出的免疫分析法具有优越的特异性。

  为进一步评价该方法的可行性，在线性范围内，将不同浓度的目标菌加入到鸡肉上清液中，按照食品安全国家标准进行预处理，并用该方法进行检测。不同浓度(5 × 101 ~ 5 × 103 CFU/mL)的鼠伤寒沙门菌在鸡肉样品中的回收率为80.27% ~ 111.34%。

  参考文献：Duan H, Qi W, Wang S, Zheng L, Yuan J, Lin J. Sample-in-answer-out colorimetric detection of Salmonella typhimurium using non-enzymatic cascade amplification. Anal Chim Acta. 2022 Jul 25;1218:339850.