CRISPR/Cas12a介导循环信号放大与电化学报告策略用于水产品中副溶血性弧菌的快速精准检测

1.引言

副溶血性弧菌是沿海及水产环境中常见的食源性致病菌，可通过受污染、未充分加热或发生交叉污染的水产品进入人体，并引起胃肠炎等疾病。传统平板培养通常需要3～7天，难以满足食品现场快速预警需求；PCR虽然具有较高灵敏度，但依赖热循环设备、专业人员和中心实验室。免疫分析和普通侧向层析方法操作相对简便，却仍可能受到抗体稳定性、显色灵敏度及假阴性结果的限制。因此，兼具等温扩增、序列特异识别和便携信号输出的检测技术成为食源性病原菌快速分析的重要方向。

本研究选择副溶血性弧菌的耐热直接溶血素基因tdh和耐热直接溶血素相关溶血素基因trh作为双靶标，利用RPA快速增加靶DNA拷贝数，再由特异性crRNA引导Cas12a识别扩增产物并激活反式切割。电极表面固定带有电化学标签的单链DNA探针，探针被切割后标签从界面释放，差分脉冲伏安电流随之改变。研究还采用低温冷冻偶联策略，将探针固定时间由常规4℃条件下约10小时缩短至-20℃条件下30分钟，从而提高传感界面的构建效率。

2.结果与讨论

RPA介导E-CRISPR检测原理与快速界面构建：鱼肉样品经快速DNA提取后，tdh和trh基因首先通过RPA进行等温扩增，扩增产物与crRNA-Cas12a复合物结合并激活Cas12a反式切割活性。阴性样品中没有靶扩增产物，电极表面的电活性探针保持完整，能够产生较强的DPV响应；阳性样品中探针被连续切割，电化学标签脱离金电极，检测电流发生明显变化。RPA的核酸扩增、Cas12a的循环切割以及电化学界面的高灵敏读出共同构成多级信号放大。

图 1 RPA介导E-CRISPR电化学生物传感器检测副溶血性弧菌的原理示意图：鱼肉样品提取DNA后，对tdh和trh进行RPA扩增；扩增产物激活Cas12a反式切割电极表面的电活性单链DNA探针。阴性样品中探针保持完整并产生较强电流，阳性样品中探针被切割、标签释放，DPV信号随之改变。左下比较了-20℃、30分钟冷冻偶联与4℃、10小时常规偶联。

双靶标识别与传感器可行性验证：针对tdh和trh设计的引物分别获得213 bp和233 bp特异性扩增产物，crRNA依据Cas12a所需的富T型PAM序列（TTTN）进行设计，并分别识别靶基因中的20 bp核心片段。荧光报告实验表明，只有靶扩增产物、Cas12a和相应crRNA同时存在时，Cas12a反式切割才能被有效激活。电化学表征进一步验证了界面构建过程：裸金电极的电荷转移电阻约为269.8 Ω；固定信号探针并用MCH封闭后，电阻升至11896 Ω；经靶标激活的Cas12a切割后，电阻降至1512 Ω，说明探针被移除并重新暴露电极活性位点。缺少Cas12a、crRNA、缓冲液或靶DNA时，电流变化率均低于8%，而完整反应体系可达到约30%。

图 2 双靶标crRNA设计与E-CRISPR可行性验证：(A、B) tdh-crRNA和trh-crRNA及其核心识别位点；(C、D) 裸金电极、探针/MCH修饰电极及靶标激活切割后电极的循环伏安和电化学阻抗结果；(E) 缺少关键反应组分时电流变化较低，完整体系产生显著响应；(F) 靶标存在与否对应不同的DPV电流。

检测条件优化与标准菌液分析性能：信号探针浓度由50 nM增加至800 nM时，电流响应持续提高，继续增加至1000 nM后增幅不明显，因此选用800 nM构建传感界面。crRNA和Cas12a浓度均优化为100 nM；Cas12a在电极表面的切割时间延长至60分钟时电流变化率明显提高，之后趋于稳定。优化条件下，tdh和trh在10¹～10⁶ CFU/mL范围内均呈良好线性，图示回归方程分别为Y=4.09X+11.94（R²=0.988）和Y=5.169X+6.37（R²=0.985），按3σ/k计算的检测限分别为10.6和11.2 CFU/mL。需要说明的是，论文摘要将总体检测限表述为32 CFU/mL，且正文中trh回归方程截距另记为3.91，与结果图存在差异；本文采用结果部分的分靶标检测限，并保留图中回归方程。

图 3 检测条件优化及标准菌液分析性能：上方(A～C)分别为信号探针浓度以及tdh、trh体系切割时间对电流响应的影响；下方(A～D)为不同浓度副溶血性弧菌样品的DPV曲线及tdh、trh靶标对应的线性校准关系。

特异性与电极稳定性评估：以铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌和鼠伤寒沙门氏菌等非靶菌作为对照时，电流变化率不超过7%；含tdh或trh靶标的副溶血性弧菌样品，以及靶菌与其他菌混合的样品，电流变化率均超过30%。双重特异性来自RPA引物和crRNA序列的共同识别，能够降低非靶扩增及非特异切割对结果的干扰。修饰电极在4℃保存5天内检测性能无明显变化，保存至第7天仍保持约90%的初始活性，说明传感界面具有一定短期储存稳定性。

图 4 RPA介导E-CRISPR生物传感器的选择性分析：(A) tdh靶标检测结果；(B) trh靶标检测结果。阴性对照及铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌和鼠伤寒沙门氏菌等非靶样品仅产生较低电流变化，而副溶血性弧菌及含靶菌的混合样品产生明显阳性响应。

鱼肉加标样品中的实际应用验证：研究在鱼肉基质中开展副溶血性弧菌加标检测，以评价方法在复杂食品样品中的适用性。

图 5 鱼肉加标样品中副溶血性弧菌的检测：(A、B) 不同浓度ATCC 33847样品的tdh靶标DPV响应及校准曲线；(C、D) 不同浓度ATCC 17802样品的trh靶标DPV响应及校准曲线。

tdh和trh的线性方程分别为Y=7.307X-6.4（R²=0.978）和Y=6.39X-0.687（R²=0.973），检测限分别为18.7和13.1 CFU/mL。实际样品性能略低于标准菌液，可能与DNA提取效率、食品基质效应及反应抑制物有关。ATCC 33847和ATCC 17802样品的加标回收率分别为103.5%～104.1%和90.6%～105.1%，表明该方法可用于鱼肉中副溶血性弧菌检测。

3.总结

本文构建的RPA介导E-CRISPR电化学生物传感器将等温核酸扩增、CRISPR/Cas12a特异识别与电化学信号读出有机结合。tdh和trh双靶标设计提高了副溶血性弧菌识别的可靠性，Cas12a反式切割实现循环信号放大，低温偶联则缩短了电极制备时间。该平台在标准菌液和鱼肉样品中均表现出较低检测限、良好选择性及可接受的回收率，且检测设备具有小型化潜力，适合水产品安全现场筛查。与此同时，该方法仍需独立完成RPA扩增和电极表面切割，反应时间、传感电极保存期及复杂基质适应范围仍有进一步优化空间；作者提出后续将通过重新设计引物和crRNA，探索单核苷酸多态性的快速区分。

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.bios.2025.117284