让链球菌"铁死"！葡萄糖酸亚铁/海藻酸钠水凝胶诱导溶血性链球菌铁死亡并治愈感染

化脓性/溶血性链球菌（Streptococcusspp.）是引起皮肤软组织感染、坏死性筋膜炎及中毒性休克综合征的重要病原体，近年日本等地"食人菌"（STSS）感染激增，病死率高达30%。临床一线依赖青霉素类等抗生素，但链球菌耐药株（如大环内酯类、四环素耐药）持续出现，且全身性抗生素难以在局部创面维持有效浓度，长期应用破坏正常菌群。因此开发不依赖传统抑菌靶点的新型局部抗菌敷料迫在眉睫。铁死亡（Ferroptosis）是2012年提出的铁依赖调节性细胞死亡形式，以胞内Fe²⁺蓄积、ROS爆发及脂质过氧化（LPO）为特征，近年发现该机制也存在于真菌和部分细菌中，且不受经典耐药机制影响，是抗耐药菌感染的新突破口。游离Fe²⁺易氧化失活且局部浓度难控制，需合适载体。海藻酸钠（SA）可与二价阳离子（Ca²⁺/Fe²⁺）形成离子交联三维网络，生物相容性好、保湿性强，是理想的创面敷料基质；抗坏血酸（ASC）可保护Fe²⁺不被氧化。

本研究先筛选五种亚铁化合物确认葡萄糖酸亚铁（FeGlu）对S. hemolyticus最强杀菌活性并验证其诱导铁死亡的特征（Fe²⁺内流、ROS↑、LPO↑、抑制剂可挽救），再将FeGlu+ASC掺入SA制备复合水凝胶，系统表征理化性能（流变、FTIR、SEM、自愈合）、体外抑菌/抗其他链球菌谱、对人皮肤成纤维细胞（HSF）生物相容性及杀灭感染细胞内外菌能力，并通过蛋白质组学探讨FeGlu-水凝胶干扰的细菌代谢通路，验证其作为非抗生素抗链球菌敷料的潜力。

图1.FeGlu对S. hemolyticus的体外杀菌效果

五种亚铁化合物（FeCl₂、FeGlu·H₂O、FeGlu、FeLactate、FeSO₄）低浓度（≤256 μM）杀菌率均未达99.9%，其中FeGlu杀菌最强；浓度梯度实验示2 mM FeGlu可杀灭>99.99% S. hemolyticus S19-1。PI染色流式及荧光显微镜见处理组强红荧光（死菌），对照弱；SEM观察2 mM FeGlu孵育6 h后菌体皱缩、膜破裂、内容物泄漏。选定2 mM为最适杀菌浓度用于后续研究，明确FeGlu具快速强效杀S. hemolyticus作用。

图2.FeGlu诱导S. hemolyticus发生铁死亡

FeRhoNox-1探针示FeGlu致胞内游离Fe²⁺升高；DCFH-DA检得ROS爆发性增加，C11-BODIPY示脂质过氧化显著增强--三者均为铁死亡标志。加入Fenton反应抑制剂Liproxstatin-1（LIP-1）、ROS清除剂N-乙酰半胱氨酸（NAC）或脂质过氧化抑制剂谷胱甘肽（GSH）后，细菌存活率回升、LPO水平下降，流式荧光负偏移。证FeGlu通过Fe²⁺参与Fenton反应生成·OH，引ROS及PUFA脂质过氧化积累，以铁依赖方式诱导S. hemolyticus铁死亡，且该死亡可被经典铁死亡抑制剂挽救。

图3.FeGlu-海藻酸钠水凝胶制备与表征

SA+FeGlu+ASC（抗氧化保护Fe²⁺）制得透明复合水凝胶；无ASC组因Fe²⁺氧化杀菌率仅22%，加2 mM ASC无单独杀菌性但维持Fe²⁺活性。手背涂抹实验证良好铺展性与伤口贴合能力；切开重组示染料扩散愈合→自愈合性（动态氢键/离子键）。流变示剪切变稀（可注射），2 mM Fe²⁺组G'最高、粘弹最稳（>应变范围），过量Fe²⁺削弱水合致黏度降。FTIR羧基峰红移(1636→1607 cm⁻¹)证SA-COO⁻与Fe²⁺配位交联；XRD无非晶锐峰证无序交联；SEM见随FeGlu↑孔隙连通↑，增强载药/保水性。选定2 mM FeGlu-SA水凝胶后续实验。

图4.水凝胶诱导铁死亡的蛋白质组学分析

2 mM FeGlu水凝胶处理S. hemolyticus后DIA定量检出238个差异蛋白（134下/104上）。KEGG富集于糖异生/糖酵解、氧化磷酸化、核糖体——与铁死亡及RNA合成相关；也涉及蛋白转运、肽聚糖生物合成等基本代谢。GO注释193个蛋白。热图示细胞色素（coaC、cydB）、代谢相关（aphA、rpoZ）下调；铁转运/代谢（feoB、fhuC、sufD）及死亡调控相关（glms、ccpN）上调。表明Fe²⁺扰乱跨膜转运、大分子合成及呼吸链，铁稳态相关基因应激性诱导，多角度破坏菌正常生理致铁死亡，与表型吻合。

图5.生物相容性与抗菌/抗细胞感染评价

CCK-8示1–3 mM FeGlu水凝胶处理HSF细胞1/3/5 d存活率均>70%（无细胞毒）；PI/Hoechst双染流式Q4区活细胞为主。HSF感染S. hemolyticus（MOI=10）模型：未处理组PI强红荧（细胞死亡），FeGlu水凝胶提取液处理组基本无广泛死细胞；涂布平板证水凝胶彻底清除培养液中S. hemolyticus S19-1。额外测试示对肺炎链球菌（S. pneumoniae）和变异链球菌（S. mutans）亦有强杀菌--具链球菌广谱活性。综合证该水凝胶选择性杀致病菌而不伤正常真皮成纤维细胞，适合创面局部应用。

本研究首次在溶血性链球菌中证实FeGlu可通过胞内Fe²⁺蓄积→Fenton反应→ROS爆发及脂质过氧化诱导典型铁死亡（LIP-1/NAC/GSH可挽救）。将FeGlu与抗坏血酸共载入海藻酸钠制备离子交联复合水凝胶，Fe²⁺与SA羧基配位形成稳定三维网络并赋予剪切变稀、自愈合及互联多孔结构，ASC有效防Fe²⁺氧化维持杀菌活性。含2 mM FeGlu的水凝胶对S. hemolyticus杀菌率>99.9%，蛋白质组揭示其干扰铁转运、糖代谢、肽聚糖合成及呼吸链；对人皮肤成纤维细胞无毒性，并在细胞感染模型中有效清除胞外菌保护宿主细胞，且对S. pneumoniae及S. mutans具广谱链球菌杀伤力。该FeGlu-SA水凝胶制备简便、生物相容佳，通过诱导病原菌铁死亡规避传统耐药机制，为链球菌感染创面敷料提供了非抗生素新范式，后续需开展动物感染创面体内疗效及长期安全性验证。

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.ijbiomac.2025.145900