纳米凝胶诱导变链菌GAPDH亚硝基化抑乳酸生成，防牙釉质脱矿

龋病是全球最常见的口腔慢性疾病，变异链球菌（S. mutans）利用食物糖类合成胞外多糖（EPS）黏附牙面并形成致密生物膜，发酵产乳酸致局部pH降至4.5–5.0引发釉质脱矿。现行机械清创难彻底清除深袋菌斑，氯己定穿透差且有耐药/着色风险，氟化物需谨慎防氟斑牙。一氧化氮（NO）具广谱抗菌——破坏膜、蛋白及DNA，并能经激活细菌磷酸二酯酶（PDEs）降解c-di-GMP抑制EPS合成、促生物膜分散，且不易诱发经典耐药；但NO半衰期极短，小分子NO供体难穿透EPS屏障。聚酰胺-胺（PAMAM）因丰富伯/仲胺可高效负载NONOates，但水溶性PAMAM被动穿透生物膜受限。S. mutans可经葡糖基转移酶（Gtfs）及内右旋糖酐酶主动摄取外源右旋糖酐并将其掺入EPS，右旋糖酐是FDA批准的安全多糖。部分氧化右旋糖酐醛基可与PAMAM氨基形成可逆希夫碱动态交联制成纳米凝胶，既保护NO负载又赋予酸响应降解性。

本研究利用此"特洛伊木马"策略构建ODex-PAMAM动态交联NG/NO，系统表征其理化性质、酸触发降解与NO释放动力学、细胞/血液相容性、S. mutans对NG/NO主动摄取及生物膜穿透深度、体外抑菌/抗生物膜效能（c-di-GMP、EPS、胞内ATP/蛋白渗漏）、NO对糖酵解关键酶GAPDH的S-亚硝基化及乳酸抑制效果，验证其作为防龋非抗生素局部制剂的潜力。

图1.纳米凝胶制备与表征

ODex氧化度35.66±2.24%；ODex:G3-PAMAM=1:1.3时PDI最小、产率~80.4%选为最佳投料比。UV-Vis 315 nm（C=N Schiff碱）、FTIR 1628 cm⁻¹（νC=N）及1269 cm⁻¹（NONOates N=N-O⁻）证实希夫碱交联与NO成功负载。Zeta电位+25.4 mV（正电利吸附负电菌斑），水合粒径~140 nm、PDI 0.18，TEM呈规整球形。XPS N1s谱伯/仲胺峰减弱、398.59 eV新N=N峰出现证NO结合PAMAM氨基。EDS估算PAMAM占干重82.85%。综合证NG/NO结构完整、尺寸适宜穿透生物膜。

图2.生物安全性评价

CCK-8实验结果显示≤100 μg/mL NG/NO对L929、hPDLSCs、MC3T3-E1、HGFs存活率>90%，250 μg/mL时仍>80%（MIC仅8 μg/mL，治疗窗宽）。HGFs经NG/NO处理胞内ROS（DCFH-DA）及上清IL-6与对照无差异，无炎症激活。溶血实验各浓度溶血率<2%（ISO标准<5%），血液相容性优良。数据表明NG/NO在治疗浓度下对口腔相关细胞及血液均安全，满足局部口腔应用前提。

图3.双酸响应NO释放性能

pH 7.5/6.5下NG/NO稳定（315 nm吸光度变化<10%），pH 5.5/4.5时希夫碱快速水解降解（TEM见解体为<50 nm碎片增大接触面积）。Griess检测：pH 4.5/5.5组10 min内NO释放量超中性环境60 min总量，达mmol级；PAMAM/NO无pH依赖性且负载量低。R-NG/NO（希夫碱还原锁死）在pH 4.5早期释放显著慢于NG/NO但总累积量相当，证希夫碱酸解贡献~20–30%加速效应，NONOates酸解提供总量。4℃暗储30天粒径/NO释放几无变化，稳定性好。

图4.体外抗菌活性

DAF-FM DA荧光示NG/NO释NO入菌内。MIC=8 μg/mL，MBC=32 μg/mL（NG为128 μg/mL，PAMAM/NO无显著抑菌），NG/NO组SEM见菌膜凹陷皱缩、破裂，对照完整。正电荷促NG/NO吸附菌膜局部浓缩NO，协同膜破坏致死亡；单纯NG或游离NO无此效。证NG/NO具强变链菌杀灭能力且依赖NO+阳离子纳米载体协同，低于文献报道氯己定MIC(4–16 μg/mL)相当或更安全无染色副作用。

图5.生物膜穿透性能

Cy5.5标记示PAMAM仅表面吸附（穿透差），NG因含Dex被S. mutans Gtfs介导主动摄取穿透>50%，NG/NO穿透深度>70%生物膜厚度（4 h）。蔗糖（Gtfs抑制剂）预处理后穿透显著降，RT-qPCR示NG/NO上调gtfs（gtfB/C/D）表达促主动转运。NO轻微氧化生物膜表层EPS助渗。CLSM 3D重建证NG/NO均一分布于整个生物膜断面，"特洛伊木马"+NO辅助双重机制克服EPS屏障，远优于商用PAMAM/NO。

图6.生物膜清除活性

结晶紫定量结果说明32 μg/mL NG/NO处理成熟生物膜 生物质减少>80%（NG或PAMAM/NO无效），离体牙面菌斑染色近似无生物膜组。机制探究：NG/NO(4 μg/mL)↑PDEs活性→c-di-GMP↓→胞外多糖合成↓；32 μg/mL时菌胞质蛋白渗漏、ATP骤降（膜氧化损伤）。低浓度NG/NO主要通过c-di-GMP降解分散生物膜，高浓度叠加直接杀菌。证NG/NO经"分散+杀灭"双途径高效瓦解S. mutans菌斑。

图7.抑制细菌产酸作用

NG/NO(4 μg/mL, sub-MIC)处理S. mutans 48 h培养液pH维持~7.0（对照降至<6.0），乳酸、1,3-二磷酸甘油酸↓，甘油醛-3-磷酸↑，GAPDH酶活性显著受抑。Western blot证NO诱导GAPDH Cys残基S-亚硝基化阻碍四聚体组装阻断糖酵解。残留存活菌因代谢抑制最终也难以持续存活。表明NG/NO不仅杀菌，还能在低浓度下切断产酸源头改善酸性微环境，具预防釉质脱矿潜力。

本研究成功构建基于右旋糖酐动态交联PAMAM的NO负载纳米凝胶（NG/NO），具规整球形（~140 nm）、正电荷及良好水分散稳定性。NG/NO借助S. mutans对右旋糖酐的Gtfs介导主动摄取穿透生物膜>70%，在龋病酸性微环境（pH 4.5–5.5）下希夫碱键断裂促NONOates快速酸解释放mM级NO。释放NO通过膜破坏直接杀菌（MIC 8 μg/mL，MBC 32 μg/mL），激活PDEs降c-di-GMP抑制EPS合成分散菌斑（>80% 生物质减少），并对糖酵解关键酶GAPDH进行S-亚硝基化抑制乳酸生成、维持中性pH防脱矿。NG/NO在治疗浓度下对口腔相关细胞及红细胞无毒性，暗储30天NO负载与释放性能稳定。该"主动摄取+双酸触发NO释放"策略克服了传统NO供体穿透差与半衰期短瓶颈，为防龋非抗生素局部制剂提供了具转化前景的新平台，后续需开展动物龋齿模型体内验证及长期安全性评价。

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.cej.2026.177893