DNA修饰的巨噬细胞内水凝胶构建的智能病原体检测器

  该研究开发了一种基于巨噬细胞(Mø)的智能细菌检测仪，可以识别、捕获、富集和检测不同的细菌及其分泌的外毒素。这项研究不仅保持膜完整性和对不同微生物的识别能力，而且可以响应外部磁铁以进行简单的细菌收集，实现一次测定中检测多种类型的细菌。此外，研究设计了一种基于碘化丙啶的染色测定法，以超低浓度快速检测病原体相关的外毒素。总体而言，这些纳米工程细胞颗粒在细菌分析中具有广泛的适用性，并可能用于传染病的管理和诊断。

  摘要：细菌感染是对全球公共卫生的主要威胁，这迫切需要有用的工具来在感染的早期阶段快速分析病原体。在此，我们开发了一种基于巨噬细胞的智能细菌检测器，它可以识别、捕获、浓缩和检测不同的细菌及其分泌的外毒素。该研究使用光活化交联化学将脆弱的天然Møs转化为坚固的凝胶细胞颗粒(GMøs)，从而保持膜完整性和对不同微生物的识别能力。同时，这些配备磁性纳米颗粒和DNA传感元件的GMøs不仅可以响应外部磁铁以进行简单的细菌收集，而且可以在一次测定中检测多种类型的细菌。此外，研究设计了一种基于碘化丙啶的染色测定法，以超低浓度快速检测病原体相关的外毒素。总体而言，这些纳米工程细胞颗粒在细菌分析中具有广泛的适用性，并可能用于传染病的管理和诊断。

  用于识别和捕获细菌的DNA-GMøs的制备示意图

  图中显示了DNA修饰的凝胶巨噬细胞的制备过程。简要地说，由于MNPs的有效内化，MøS首先与柠檬酸包被的超顺磁性氧化铁纳米颗粒孵育获得磁性细胞。同时，这些细胞被细胞因子刺激，诱导病原结合受体(如MR和CD163)表达上调。值得注意的是，我们使用RAW264.7(一种小鼠巨噬细胞系)作为基本细胞材料，它是体外实验中使用最广泛的永生化巨噬细胞之一，因为它便于大规模生产和维护，不需要添加任何诱导剂。然后，根据以前的报告，通过光引发剂((2-hydroxyl-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone，I2959)和单体(聚乙二醇二丙烯酸酯，聚乙二醇二丙烯酸酯，分子量=700Da)直接渗透和随后的紫外光照射实现细胞内的水凝胶。最后，对特定细菌作出反应的DNA传感元件(如DNAzyme)可以很容易地装饰在凝胶细胞上，以方便、快速和高灵敏度地读出荧光。因此，产生了能够识别、丰富和检测多种类型微生物的磁性DNA-GMøS。

  DNA-GMøS的制备与表征

  我们使用不同的技术来确认DNA-GMøs的成功制备。如图a所示，所得到的细胞(MNPs/Møs)与天然Møs相比变得更黑，并能迅速对外部磁铁作出反应，细胞回收率高(≈98%)。用IL-4处理后，M0型Møs转变为M2型Møs，一些独特的标记物如CD206、CD163、Arginase-1(Arg1)、Fizz1等上调。其中，只有CD163(即清道夫受体，SR)和CD206(即甘露糖受体，MR)存在于细胞膜上，直接参与细菌的识别和结合。因此，用流式细胞仪分析它们在细胞膜上的表达。作为比较，还测试了其他潜在的标记物，如TLR2和TLR4，它们可以与细菌成分结合。IL-4刺激显著促进了CD163和CD206的表达，而TLR2和TLR4的表达无显著变化(图b)，这与以前的报道一致。CD206和CD163的上调意味着与TLR受体相比，它们可能有更多机会捕获细菌。随后，通过荧光显微镜确认了细胞内区域水凝胶网络的形成。通过在交联剂混合物中引入荧光素二丙烯酸酯，水凝胶网络被染成绿色荧光，而细胞膜被亲脂性的Dil荧光团染成红色荧光。结果GMøs表现出有区别的膜和水凝胶部分(图c)，表明细胞内水凝胶化成功。此外，水暴露试验可用于快速评估Møs的水凝胶化，因为活Møs在低渗透压胁迫下迅速破裂，而具有坚固的交联内部的GMøS保持完好，没有明显的形态变化(图d)。透射电子显微镜(TEM)结果表明，与天然Møs相比，GMøs有一个穿孔的、充满水凝胶的内部(图e)。同时，在吞噬小泡中也观察到许多MNPs(图e，插图)，进一步验证了它们的磁性反应是MNPs内化的结果。为了促进DNA的修饰，使用了胆固醇标记的DNA双链，它可以通过强烈的疏水相互作用自发地插入细胞膜。为了证明这一点，我们将DNA链与荧光基团(即FITC)连接起来。GMøs在Ch/FITC-DNA(100 nM)中孵育15 min，然后进行共聚焦成像。没有胆固醇的DNA链被用作对照组。如图f所示，用Ch/FITC-DNA处理的GMøs在细胞膜上显示了绿色荧光;相比之下，用无胆固醇DNA链孵育的细胞没有显示任何荧光，从而表明DNA分子的成功表面固定是由于胆固醇的插入。根据荧光光谱的变化，DNA的平均密度估计为2.4×10⁵分子/细胞。

  环境条件下DNA-GMøs的稳定性

  为了评估所制备的DNA-GMøs的稳定性，我们对细胞进行了不同条件的刺激，如高渗压力、反复冻融循环、超声处理、高速离心和长期储存(30天)。为了进行比较，我们用活体Møs(LMøs)和多聚甲醛固定的Møs(FMøs)作为对照。如图a所示，DNA-LMøs相当脆弱，所有的处理都会导致它们迅速变形(如高渗压力)、聚集(如离心)或破碎(如超声)，使它们无法在体外进行常规实验。尽管与DNA-LMøs相比，DNA-FMøs具有更好的稳定性，但它们仍然容易受到冻融循环和超声处理的影响，这破坏了大多数细胞。令人印象深刻的是，DNA-GMøs在所有条件下都能存活，细胞形态和数量的变化可以忽略不计(图b)。总的来说，这些结果证实了DNAGMøs的高稳定性，从而促进了其下游应用，如病原体捕获和检测。鉴于在GMøs上修饰的DNA分子在细菌检测中的重要作用，也对它们在细胞膜上的稳定性进行了评估。由于细胞被凝胶化，锚定的DNA链没有内化到细胞中，它可以在膜上长期位移而没有明显的损失，由流式细胞仪和共聚焦分析确定的荧光强度变化证明了这一点(图c)。以前的报告显示，在富含蛋白质的环境中，单个胆固醇标记的DNA链容易从脂质膜上脱落，所以用流式细胞仪调查了分散在复杂生物介质(即10%血清)中的DNA链的保留时间。如图d所示，双胆固醇标记的DNA修饰的GMøs的荧光保持不变，这意味着DNA链与GMøs的分离可以忽略不计。这种稳定性的提高是由于双胆固醇对细胞膜的亲和力增强，这对后续的生物应用非常重要。

  基于GMø的细菌识别和捕获的研究

  用两种有代表性的细菌，即革兰氏阴性大肠杆菌(E. coli)和革兰氏阳性金黄色葡萄球菌(S. aureus)作为模型病原体，研究了GMøs的结合和分离病原体的性能。将GMøs与细菌悬浮液孵育15 min后，用磁铁收集细胞颗粒进行显微镜观察(图a)。显然，IL-4刺激的GMøs的捕获能力比未刺激的GMøs对两种细菌的捕获能力都要好得多(图a)。由IL-4刺激的GMøs捕获的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的菌落分别比未刺激的GMøs高4.3倍和5.5倍(图b，c)，与显微镜的结果一致。因此，受刺激的GMøs被用于随后的细菌分析。图d证实，GMøs可用于捕获其他微生物，包括铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)、副溶血性弧菌(V. parahemolyticus)、肠炎沙门氏菌(S. enteritidis)和白色念珠菌(C. albicans)。此外，用平板试验考察了它们对血浆、血清、唾液和尿液等复杂介质中细菌的捕集性能。与传统的单抗-MBs不同，GMøS的捕获能力不受复杂介质的影响(图e)，进一步强调了它们的优势，因为生物介质中含有大量可能影响分子识别的杂质。

DZ-GMøS对捕获的细菌进行特异性检测

  传感原理如图a所示。具体来说，DZEC和底物都通过胆固醇插入法固定在细胞膜上，底物具有FITC荧光团和BHQ1猝灭剂。在没有大肠杆菌的情况下，DNAzyme与底物的杂交导致FITC的荧光猝灭。然而，在分析物存在的情况下，DNAzyme被活细菌激活，导致底物的裂解和FITC荧光的恢复。由于大肠杆菌和细胞膜上的DNA传感元件之间的距离很近，我们预计从细菌中释放的CEMs将比传统的基于DNA酶的方法更有效地激活DNA酶，从而带来更好的检测性能。

  图b显示在没有大肠杆菌的情况下，DzEC-GMøs上的荧光可以忽略不计，表明这种基于细胞的传感器的背景信号很低。然而，一旦细菌被捕获，在细胞膜周围观察到强烈的绿色荧光，这表明发生了裂解反应。为了进一步证明这一点，本研究用随机DNA链(rDNA)替换了DNA酶，结果rDNA-GMøs即使在加入大肠杆菌后也没有产生任何信号。为了避免观察偏差，我们还用流式细胞仪分析了样品的平均荧光变化，在大肠杆菌存在的情况下，DzEC-GMøs和rDNA-GMøs也有类似的趋势(图c)，进一步证实了荧光是归因于DNA酶的激活。此外，这种方法的性能不会因为使用复杂的生物样品如血清、唾液和尿液而受到影响。

  接下来，流式细胞仪被用来定量检测浓度为103至107 CFU mL-1的大肠杆菌(图d，e)。由于500 CFU mL-1的荧光信号可与0 CFU mL-1的荧光信号区分开来，因此基于DzEC-GMø的大肠杆菌检测方法的检测限(LOD)约为500 CFU mL-1(图e)。这种敏感性和检测效率的提高可能是由于DzEC-GMøs可以在其表面富集细菌，细菌和DNA酶之间的距离被大大缩短。

  这种方法具有高度的特异性，其他细菌如金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、副溶血性葡萄球菌、化脓性链球菌(S. pyogenes)和白喉杆菌都不能产生可检测的信号(图f)。考虑到细菌检测方法在感染诊断和食品安全领域的应用，检测单个活细菌的敏感性是细菌检测方法的长期追求。为了解决这个问题，我们开发了一种基于DzEC-GMø的单一检测方法，其中只使用一个DzEC-GMø并在加入细菌后进行分析。在这种方法中，所有的反应都发生在一个细胞颗粒上;此外，只有一部分被激活的DNA酶足以产生可检测的信号，使得该检测方法比传统的检测平均荧光强度的方法敏感得多。为了证明这一点，将大肠杆菌分泌的相当于1个CFU的CEMs与不同浓度的DzEC-GMøs(G1-G4：1, 10, 10² , 10³个细胞)孵化0.5小时，激活后，用荧光显微镜分析细胞。如图g所示，随着GMø数量的减少，荧光明显增加，含有单个DzEC-GMø的组产生最高的信号，从而证实了我们的方法对于单活细胞检测的可行性。我们的基于GMø的细菌检测器的设计原理是高度通用的，可以很容易地适应于其他的检测器。

  细菌分泌的致孔毒素的分析

  为了进一步扩大基于GMø的平台的适用性，我们使用它来分析细菌分泌的致孔毒素(PFTs)。溶血素(HIα)是一种广为人知的外毒素，通过在细胞膜上形成孔洞来破坏细胞，导致其渗透性失衡。因此，开发准确、快速、灵敏地检测这种毒素的有效策略对剖析病原体的毒力具有重要意义。

  传感原理如图a所示。GMø膜和目标毒素之间的结合导致细胞膜上形成孔隙，从而促进了荧光分子(即碘化丙啶，PI)的渗透，这是一种不可渗透的染料到非破坏性膜上。随后，细胞中的PI荧光可以通过荧光显微镜或流式细胞仪进行快速分析。在没有Hlα的情况下，GMøS在实验期间保持黑暗(图b)。

  基于上述结果，我们使用了一种基于GMø的单一方法来超灵敏地检测Hlα。具体地说，将一个GMø与不同浓度的毒素孵育，然后用PI染料进行染色。如图c所示，GMø的PI荧光随毒素浓度的增加而增加。由于在10 fM处的荧光信号可与背景信号区分，PI染色检测Hlα的检测下限约为10 fM(图d)，显著低于先前报道的全细胞溶血试验(NM范围)、酶联免疫吸附试验(Pm范围)、荧光分析(Pm范围)和场效应晶体管传感器(NM范围)，进一步强调了我们的方法在病原相关毒素分析方面的优势。

  该方法被进一步用于分析不同细菌对细胞膜的破坏作用。为此，将GMøs与新鲜的致病菌或非致病菌(10³ CFU mL⁻¹)进行培养，然后进行PI染色实验。在这些微生物中，大肠杆菌DH5α和酿酒酵母(S. cerevisiae)是不分泌溶血性毒素的温和菌株，而V.Parhemolyticus、S. pyogenes、P. aeruginosa和C. albicans是已知能分泌PFTs或直接损害细胞膜的菌株。如图e所示，只有用致病菌的分泌物处理的GMøs显示出强烈的PI荧光(即副溶血性细菌、化脓性细菌、铜绿假单胞菌和白色念珠菌)，表明这些微生物对免疫细胞有破坏性。

  我们还使用DzSA-GMøs分析了从当地医院收集的由金黄色葡萄球菌引起的肺炎患者的真实痰样。经过简单的捕获和检测步骤后，产生的DzSA-GMøs被外部磁场收集并进行流式细胞仪分析。在本实验中，样品中金黄色葡萄球菌的存在会激活DNA酶，在细胞膜上产生绿色荧光，而Hlα可以刺激GMøS，导致PI荧光增加。如图f所示，所有患者样本都产生了金黄色葡萄球菌的阳性信号(左图)，这归因于凝胶细胞颗粒上的DNA酶的激活。这些结果表明，我们的方法具有快速分析临床样品中细菌和毒素的能力。

  结论：

  1、该研究报告了一种通过结合细胞内水凝胶技术和DNA纳米技术将活的Møs转化为智能细菌检测器的简便策略。与原生细胞相比，Møs的细胞内水凝胶化极大地提高了它们的机械稳定性，而通过MNPs的成功内化使Møs具有磁性，也提高了它们的可操作性，从而使这些细胞颗粒在实际应用中易于部署。

  2、由于制造过程温和，得到的GMøS不仅保留了捕获多种微生物(例如细菌和真菌)的识别能力，而且还可以使用DNA传感元件进行修饰，以便在一次检测中专门报告多种类型的细菌。

  3、由于GMøs的结构特性，它们可以进一步应用于分析细菌相关毒素，这不仅提供了更多关于感染细菌毒力的信息，而且进一步扩展了基于GMø的测定的适用性。总之，该研究为合理设计下一代基于细胞的生物传感器以对抗细菌提供线索。

  参考文献

  GUI Y, ZENG Y, CHEN B, et al. 2023. A smart pathogen detector engineered from intracellular hydrogelation of DNA-decorated macrophages. Nature Communications [J], 14: 2927.