一种快速精准的猴痘病毒检测方法

  目前，聚合酶链反应(PCR)检测是首选的猴痘检测方法，其中实时PCR(qPCR)技术是猴痘病毒检测和分型最有效的方法。该方法的优点是灵敏度高、通量大。但目前针对猴痘的PCR检测试剂存在检测时间长、稳定性差、操作繁琐、与其它正痘病毒存在交叉反应的风险等缺陷。而且，猴痘病毒感染潜伏期较长，实时荧光定量PCR分子诊断方法对样品采集、实验操作人员及配套检测设备有较高要求，无法保证快速鉴别感染者。目前没有可以广泛使用的商业 PCR检测试剂盒。因此，针对猴痘病毒有效的快速、灵敏、精准的检测方法亟需建立。

  2023年10月16日，中国医学科学院病原生物学研究所郭斐课题组在 Cell Reports Methods 期刊发表了题为：Rapid and sensitive one-tube detection of mpox virus using RPA-coupled CRISPR-Cas12 assay 的研究论文。

  该研究建立了一种快速精准的猴痘病毒检测方法，通过将等温扩增(RPA)与CRISPR-Cas12a的检测体系联合，可以实现猴痘病毒DNA在30分钟内的快速检测，检测灵敏度1个拷贝数，同时能够精准区分其他正痘病毒以及猴痘病毒，具有良好的实用价值。

  研究团队首先设计了两个crRNA的检测体系池，其中一组靶向正痘病毒(包括痘苗病毒、天花、牛痘以及猴痘)的保守区D6R和E9L，可以检测所有的正痘病毒;另外一组靶向猴痘病毒特有的区域N3R和N4R。通过对crRNA的设计和筛选，建立了基于CRISPR/Cas12a的荧光报告体系(图1)。

  图1：CRISPR-Cas12a检测体系的建立及crRNA的筛选

  进一步针对选择的crRNA，分别检测不同拷贝数的质粒模板以及病毒DNA模板，观察到CRISPR-Cas12a单独检测体系的检测限约为108拷贝数，不同crRNA的联合可以将检测限提高到107拷贝数，同时实现了正痘病毒与猴痘病毒的区分。并且为了实现最低检测限，研究团队团队将等温扩增(RPA)与CRISPR-Cas12a的检测体系联合，最终能够达到1个拷贝的最低检测限，大大提高了检测体系的灵敏度(图2)。

  图2：RPA联合CRISPR-Cas12a检测体系的实现1个拷贝的最低检测限

  为了验证检测体系实际应用的可靠性与准确性，针对中国大陆第一例猴痘病例的拭子样本进行了检测。该体系同样实现了1个拷贝数的最低检测限，并且成功的在病人咽拭子，鼻拭子以及水泡拭子中检测到了猴痘病毒的DNA，证实了体系应用的可靠性。同时针对猴痘病毒核酸检测试剂国家参考品的检测，阴性参考品中未检测到猴痘病毒的DNA，进一步证实了检测体系的准确性(图3)。

  图3：RPA联合CRISPR/Cas12a检测体系对临床样本的检测

  最终为了提高检测效率，进一步优化反应体系到单管中，大大的缩短了检测时间以及操作步骤。在提取得到待测DNA后，15分钟到30分钟内即可实现样本的快速检测，且灵敏度高达1个拷贝数。相比于传统荧光PCR的2小时，大大缩短了检测时间，提高了检测的灵敏度(图4)。

  图4：RPA联合CRISPR-Cas12a检测体系的优化

  综上所述，该研究建立了猴痘病毒的快速精准的检测方法，通过crRNA的筛选建立了一套CRISPR检测体系，并联合等温扩增实现了猴痘病毒的快速、灵敏的精准检测。为猴痘病毒的快速诊断提供了有力的技术支持。

  论文链接：

  https://www.cell.com/cell-reports-methods/fulltext/S2667-2375(23)00284-9