超灵敏和特异性噬菌体@DNAzyme探针触发荧光点借助智能手机用于食源性病原菌的现场检测

  噬菌体作为一种感染宿主细菌的病毒，在生物传感器的开发中作为一种替代的生物识别原件受到广泛的关注。与适配体、多肽、抗体等多种生物受体相比，噬菌体普遍存在，易于从自然界中筛选，稳定性强，在恶劣环境条件下也能保持生物活性。更重要的是，噬菌体对目标细菌具有极强的亲和力和特异性，甚至达到菌株水平。然而，到目前为止，大多数已报道研究中，噬菌体仅作为生物受体元件，其检测信号直接来自传感表面的化学/物理变化，这限制了它们的灵敏度。因此，如何设计合适的信号放大策略，在保持高灵敏度的同时又拥有简单的操作，对于设计基于噬菌体的生物传感器来说是非常重要的。

  自2001年起，点击化学以其反应条件温和、正交反应性能好、反应效率高等优点得到了广泛的研究，特别是Cu(Ⅰ)催化的炔烃-叠氮加成反应被广泛应用。然而，CUAAC通常在催化条件下产生Cu(Ⅰ)，它会产生活性氧来破坏生物分子。此外，高浓度的Cu(Ⅰ)对活细胞是有毒的。相比之下，Cu(Ⅱ)不仅避免了额外的还原剂和配体，而且避免了Cu(Ⅰ)对细胞的毒性。

  近日，宁波大学余镇重等提出了一项超灵敏和特异性噬菌体@DNAzyme信号探针用于检测食源性致病菌的报道。该传感探针由筛选的噬菌体和功能化的脱氧核酶组成，分别实现了在菌株水平对目标食源性致病菌的特异性识别和对铜(II)基叠氮炔环加成(CuAAC)点击反应的高效催化。如图1，作为概念的证明，首先通过4-巯基苯硼酸修饰的金载玻片从复杂的食品样品中富集和纯化作为代表性分析物的大肠杆菌O157:H7。随后，噬菌体@DNAzyme探针与捕获的大肠杆菌O157: H7特异性结合，并在Cu(II)的辅助下催化3-叠氮基-7-羟基香豆素和3-丁炔-1-醇之间的点击反应，产生可见的荧光信号。最后，通过智能手机测量相应的荧光信号，以量化目标浓度。

  图1 噬菌体@DNAzyme探针的合成过程及设计的基于噬菌体的生物检测示意图

  研究首先制备了噬菌体@DNAzyme探针，通过透射电镜观察噬菌体和噬菌体@DNAzyme探针的形态，并通过凝胶电泳进一步证明探针的成功合成。同时，利用扫描电镜对用于富集食源性致病菌的4-巯基苯硼酸修饰的金载玻片的表面形貌进行了表征，并利用能量色散谱图证明该用于菌富集的玻片的成功制备。接着探究了制备的探针的特异性和亲和力。值得注意的是，为了使生物测定适合现场检测，该研究使用智能手机开发了量身定制的便携式荧光仪。其内外部结构如图2A-B，测试操作如图2C。顶部开口用于智能手机观察，样品置于观察口下面。采用三个串联绕线发光二极管灯作为激发光源。特别引入一个小的固定挡板，以促进光的线性传播，防止光源的散射。侧面的滑动挡板便于样品进样，并防止外部光线。在优化的条件下，生物测定在较短的时间内有较宽的线性范围(102～108 CFU/mL)(图2F-2G)，检测限为50 CFU/mL(S/N =3)。该方法进一步扩展到另一种食源性致病菌鼠伤寒沙门氏菌的检测，显示出令人满意的检测性能。

  图2 (A)-(C)定制便携式荧光仪的结构;(D)和(E)分别为不同浓度的大肠杆菌O157：H7和鼠伤寒沙门氏菌的生物测定荧光照片;(F)和(G)分别为智能手机获得的B值与大肠杆菌O157：H7和鼠伤寒沙门氏菌浓度的对数之间的校准图。

  建立的方法应用于检测实际样品猪肉和牛奶中的大肠杆菌O157：H7以验证可行性，并与国家标准方法(GB4789.3-2016)进行比较。结果表明，该方法能准确检出食品样品中大肠杆菌O157：H7的浓度。

  总的来说，该方法显示出几个优点。首先，制备的脱氧核酶@DNA探针对细菌具有良好的特异性，同时对检测信号的荧光电极反应具有较高催化效率。其次，将金载玻片富集和脱氧核酶@DNA探针催化这两种协同信号放大策略与简单的智能手机视觉荧光信号检测相结合，实现了30 min内快速、灵敏的细菌现场检测，LOD可低至50 CFU/mL。此外，该生物测定方法通过使用相应的噬菌体易于推广到其他细菌的检测，具有建立通用细菌传感平台的巨大潜力。该项研究为食品中细菌污染的控制提供了一条新的途径。

  论文链接：https://doi.org/10.1021/acs.analchem.3c00603