“耐受伞”用于检测葡萄球菌肠毒素B的纳米抗体光热侧流免疫分析法

  摘要：提高侧向流动免疫分析(LFIA)的稳定性和灵敏度是分析化学领域永恒的主题，近年来出现的新型分子识别元件(MRE)和各种检测信号提供了潜在的生物学和技术可能性。在这里，我们创新性地报道了一种纳米抗体(Nbs)武装的光热侧向流动免疫分析法(NLFIA)，其中Nbs充当了"耐受伞"的角色，大大提高了LFIA的稳定性。与此同时，通过多巴胺(PDA)辅助两步法合成的光热材料金核瓣纳米粒子(CPNs)也能提高可读信号的灵敏度。经过对葡萄球菌肠毒素B(SEB)的概念验证，我们发现新型NLFIA不仅能"对症下药"提高试纸条对检测环境的耐受性和目标物的特异性，还能在保证检测灵敏度的前提下提高分析结果的准确性和可理解性。NLFIA的检测限为1.68 ng/mL-1(比色模式)和0.58 ng/mL-1(光热模式)，比金标准方法(14.80 ng/mL-1)低25倍。此外，所提出的方法还成功地应用于食品中SEB的检测，准确度很高。本研究将新型MRE与光热LFIA相结合，为开发更灵敏、更稳定的食源性致癌物质检测平台提供了参考。

  方案1：(A)获得纳米抗体的过程示意图;(B)CPN的制备过程示意图;(C)比色/光热双信号LFIA的原理和结果示意图。

  本文构建了一种以Nbs为MRE的光热侧流免疫分析(NLFIA)，以全面提高LFIA的稳定性和灵敏度，并在葡萄球菌肠毒素B(SEB)中进行了概念验证。抗SEB的Nbs(抗SEB Nb7)已在骆驼体内成功培育，并在我们之前的工作中进行了亚克隆和表达，其制备过程如方案1A所示。通过简单的两步PDA法制备得到的金核-瓣纳米粒子(CPNs)是一种各向异性的支化纳米结构，具有较高的结构精度和可控性，具有明亮的黑蓝色和优异的光热转换性能，可用于比色和光热双信号输出。所构建的NLFIA结合了Nbs和双信号读出模式的优点：(1)与单克隆抗体(mAbs)相比，使用Nbs作为LFIA的MRE可以起到"耐受伞"的作用，从而提高条带对检测环境的耐受性和靶向SEB的特异性。(2)PDA辅助合成的CPN外层紧密排列的金花瓣和残留的PDA涂层赋予了材料强大的光热转换能力，通过提高光热信号的灵敏度可以更精确地定量监测LFIA，从而满足了双信号模式的需要。这种新型NLFIA具有操作简单、稳定性好、特异性强等优点。

  CPNs的表征

  在典型实验中，通过种子生长策略合成了近似球形均质颗粒的AuNPs(60 nm)(图1A中60 nm-AuNPs的TEM图像)。然后，在碱性条件下加入DA-HCl，形成PDA包覆的AuNPs，这在图1B中可以清楚地观察到。X射线光电子能谱(XPS)也证实了PDA涂层的存在，与AuNPs(60 nm)相比，AuNPs@PDA的元素组成中出现了氮(图1F)，并且与Au 4f5/2(84.07 eV)和Au 4f7/2(87.67 eV)相对应的结合能分别发生了0.1和0.2 eV的移动。最后，HAuCl4的加入进一步促进了高支化CPN的形成，经动态光散射(DLS)测定，其尺寸约为120 nm，其结构形态为AuNP核心上紧密排列的质子花瓣(图1C)。

  在HR-TEM图像(图1D)中，d间距为0.23 nm的清晰晶格条纹可以正确地对应于金。此外，在CPN的元素图谱中(图1E)，金元素呈中心密集、周围稀疏的排列，这也表明CPN周围的金花瓣是成功合成的。此外，CPN的元素图谱(图1E)中的氮元素和XPS分析(图1F)都证明了CPN被破坏后残留的PDA涂层。此外，如紫外-可见光谱(图1G)所示，由于CPNs表面高支化金纳米金属的多模态耦合作用，CPNs在可见光区域覆盖了很宽的范围。而且与AuNPs相比，CPNs的颜色变化进一步证明了材料的合成，明显的蓝黑色溶液也更有利于LFIA 色度信号的目视观察。最后，利用zeta电位研究了CPNs@mAbs探针的合成过程。如图1H所示，纳米金属片生长后CPNs的zeta电位升高至-34.5 mV，耦合抗SEB mAbs-det后明显升高至-16.1 eV，表明mAbs被修饰在CPNs表面，成功形成了CPNs@mAbs探针。

  CPNs的光热性能

  我们进一步探讨了CPNs作为示踪剂在LFIA中产生光热信号的性能。光热图像(图2A)和温度变化曲线(图2B)直观地显示了不同浓度的CPNs在808 nm激光(2 W cm-2)照射下10 min内温度随时间变化的结果。更具体地说，开始时CPNs的温度随着浓度的增加而升高，5 min后趋于稳定，这对于在LFIA中实现即时检测至关重要。此外，温度循环测试选用的CPNs(200 μg/mL)在温度达到峰值时自然冷却10 min。如图2C所示，在三个激光器开/关循环中，循环加热曲线基本一致，这表明CPNs具有热转换稳定性和稳定的开关效应。此外，AuNPs(15 nm)、AuNPs (60 nm)、AuNPs@PDA和CPNs都在近红外光照射约10 min后达到最高温度，但CPNs(ΔT = 61.1℃)在相同的激光照射条件下(808 nm，2 W cm-2)显示出比其他物质(ΔT ≤ 55.3℃)更好的光热效果(图2D)。同时，根据传热时间常数(τs)和最高温度的结果，基于式(1)和式(2)计算出CPNs的光热转换效率(η)大约为49.43%(图2E)，与已报道的一些金支化质子纳米结构相比具有明显优势。我们推断CPNs的卓越光热效应主要归因于两个因素：(1)AuNP内核上的各向异性金纳米颗粒结构可产生基于等离子体耦合的强光信号，这是光热效应的有效特征。(2)PDA涂层，它既能通过自身的氧化破坏作用促进金纳米金属在CPN表面的各向异性生长，同时其本身也是一种潜在的光热材料，η值高达40%。总之，具有优异光热转换特性的CPN是良好的光热信号示踪剂，为进一步开发双信号LFIA提供了必要的先决条件。

  NLFIA和mLFIA的耐受能力比较

  对于大多数免疫测定来说，抗体的稳定性是限制其进一步应用的关键因素。抗体在生产、运输、储存和使用过程中容易受到周围环境结构变化的影响，进而影响其对目标物的分析性能。然而，纳米抗体作为基因工程抗体，其显著的结构优势使其对周围环境的抵抗力更强，这为提高免疫测定的稳定性提供了新的可能。在此，我们对有Nbs参与的LFIA和仅应用mAbs的LFIA(分别称为NLFIA和mLFIA)进行了简要的比较研究，两者都使用CPNs@mAbs作为信号探针。NLFIA试剂条遵循实验部分所述的组装原则。根据我们之前的方法制备的Nb7在15% SDS-PAGE中显示为单条带，分子量约为17 kDa，这一分子量与Nbs的理论值一致(图3B)，并显示出典型的β-片层圆二色性(CD)光谱(图3C)，在218 nm波长处出现贯穿信号。mLFIA试剂条的组装方法如补充信息中所述，只是将固定在NC膜T线上的Nbs换成了mAbs(Biotyscience ABN3591)，后者也可以与CPNs@mAbs探针"配对"，最终在T线上与SEB形成夹心免疫复合物。

  分别研究了离子强度、pH值、免疫反应进行时缓冲液的温度以及条带的储存温度对T线颜色的影响，以相对于最佳条件(100%强度)的光密度作为评价指标。从图3E中可以看出，PBS(10 mM)对两种LFIA的T线黑蓝色条带(与CPN的颜色一致)的影响最小，随着PBS浓度的增加(从10 mM到100 mM)，条带的颜色逐渐变浅。然而，与mLFIA(减少29.33%)相比，NLFIA的总体变化要小得多，而且在10至20 mM PBS浓度之间没有突然减少(仅减少约3.4%)。同样，在NLFIA中，pH值的变化(从pH = 5到9)导致T线黑蓝带的变化较小(比mLFIA的变化小18.04%)(图3F)。从这两幅图可以看出，Nbs的使用提高了LFIA对离子强度和pH值的耐受性。至于运行缓冲液的温度变化，似乎并没有导致两种LFIA的T线颜色变化出现明显差异(图3G)。然而，出乎我们意料的是，NLFIA的T线颜色在80℃至85℃的7个储存温度下几乎没有变化(仅减少了26.89%)，在85℃储存8小时后保留了73.11%的色度，而mLFIA在相同条件下几乎完全失色(仅保留了0.25%的色度)(图3H)，这可能是由于在免疫测定中引入了热稳定的Nbs。熔化温度(Tm)通常被用作评估Nbs热稳定性的指标，Nbs的熔化温度通常在50到80℃之间。如图3d所示，用CD分析Nb7的Tm为72.2 ± 0.3℃，表明Nb7即使暴露在相对较高的温度下也能保持结构稳定。此外，以相对于最佳状态(100%强度)的温度变化作为评价指标，研究了上述因素对T线温度变化的影响。结果显示，在光热模式下，NLFIA对离子强度、pH值和温度的耐受性明显优于mLFIA，且变化趋势与比色模式下相似。

  NLFIA的分析性能

  在最佳条件下评估了NLFIA的分析性能，并与优化后的传统金标准方法(AuNPs-LFIA)进行了比较。如图4A所示，当SEB浓度从0升至512 ng/ml时，T线的蓝黑色逐渐加深，这是因为固定在NC膜上的Nbs捕获了更多的SEB后形成了夹层结构。相应地，由于夹层结构的形成，图4B所示的HITC光热图像(808 纳米激光照射5 min后)也随着SEB浓度的增加而出现温度逐渐升高的现象(T线所在位置由黄色变为白色)。比色模式和光热模式的视觉检测限(vLOD)分别为2 ng/mL和1 ng/mL，表明NLFIA的视觉灵敏度优于AuNPs-LFIA(如图4C所示，vLOD为16 ng/mL)。为了更精确地评估NLFIA的检测性能，分别建立了T线强度(通过Image J分析获得)和温度变化(ΔT)与SEB浓度的标准曲线。LFIA的灵敏度通过计算的检测限(cLOD)进行评估，检测限由平均空白信号 ± 3 × 空白的标准偏差确定。比色模式的拟合线性方程(图4D)为y = 7279.51 lg(x) - 1521.08(R2 = 0.9979)，计算出的检出限(cLOD)为1.68 ng/mL。

  光热模式的拟合线性方程为y = 14.9975 lg(x) + 3.9342(R2 = 0.9976)，据此计算出cLOD为0.58 ng/mL(图4E)。NLFIA两种模式的拟合线性方程均显示出良好的线性关系(R2 > 0.99)。同时，AuNPs-LFIA的相应拟合方程为y = 11445.98 lg(x) - 12797.47(R2 = 0.9963)，cLOD为14.80 ng/mL(图4F)。相比之下，CPNs的高效光热转换能力使光热模式的cLOD比比色模式提高了2.90倍，比AuNPs-LFIA提高了25.52倍，并有效地扩展了SEB的检测范围。

  此外，将试纸和探针连续储存15天，并在储存期间每天进行测试。如图4G所示，15天内NLFIA比色和光热信号的变异系数分别为1.68%和3.06%。表明NLFIA在检测SEB方面具有良好的稳定性。

  接下来，对NLFIA的特异性进行了研究。众所周知，由于大多数哺乳动物Ig的Fc区与葡萄球菌蛋白A(SpA)有很强的结合力，基于mAbs的传统免疫测定往往会产生严重的假阳性结果。而由于Nbs只存在于VHH，从根本上避免了检测SEB时SpA被非特异性捕获的可能性。具体来说，在一系列浓度的SEB(从0到150 ng/mL)中分别加入0、1和100 ng/mL的SpA标准品后，进行NLFIA程序。各浓度SEB的比色信号几乎完全不受SPA的干扰。除SpA外，NLFIA程序还对其他潜在干扰物进行了检测，如葡萄球菌肠毒素，包括SEA、SEC、SED、SEE(以PBS为对照)。如图4H所示，100 ng/mL的潜在干扰物对比色或光热信号均无干扰，表明NLFIA对检测SEB具有很好的特异性。

  最后，通过对三种常见的SEB污染食品进行回收实验，验证了NLFIA的实际应用。在牛奶、奶粉和猪肉样品中分别添加一系列SEB标准品(5、10、50和100 ng/mL)，然后进行NLFIA程序。如图4I所示，在比色模式下，加标SEB的平均回收率为92.95%至109.44%，相对标准偏差(RSD)小于11.10%;在光热模式下，加标SEB的平均回收率为87.06%至112.70%，RSD小于11.13%。因此，所建立的NLFIA在检测食品样品中的SEB方面具有良好的应用潜力。

  结论：

  1、为了满足对食源性毒素检测灵敏度和稳定性的更高要求，提出了一种基于Nbs和金核瓣纳米颗粒(CPNs)的新型光热侧流免疫分析法(NLFIA)来检测食品中的SEB，其中以Nbs代替抗体作为MRE，充当LFIA的"耐受伞"。

  2、作为MRE，Nbs在结构上的天然优势使其在各种极端条件下(如离子强度、pH值、温度等)的耐受性更强，对目标的特异性更高，从而提高了LFIA的稳定性和特异性。

  3、双信号示踪剂CPNs采用PDA辅助两步法制备。CPNs表面的纳米颗粒结构和残留的PDA涂层使材料具有良好的光热效应(η = 49.43%)，从而产生更灵敏的光热信号。

  4、综合上述优点，NLFIA在检测SEB时具有更好的cLOD(比色模式为1.68 ng/mL，光热模式为0.58 ng/mL)、更高的环境耐受性和更强的特异性(几乎完全避免了SpA的干扰)，为检测食源性毒素提供了更广泛的分析应用价值。

  参考文献

  WU H, LI Y, LI Y, et al. 2023. The “umbrella of tolerance”: Nanobodies-armed photothermal lateral flow immunoassay for the detection of staphylococcal enterotoxin B. Chemical Engineering Journal [J], 470: 144273.