多重PCR-侧流试纸法检测产生热稳定性直接溶血素的副溶血性弧菌

  副溶血性弧菌是一种革兰氏阴性、嗜盐性海洋细菌，患病率在12种致病性弧菌中最高。因此，海鲜是致病性副溶血性弧菌污染或爆发的主要来源，这对海鲜行业产生了负面影响。通常，10⁵至10⁷个细胞被认为是疾病致病性的感染剂量，潜伏期为4-96小时，导致疾病持续2-3天。副溶血性弧菌感染的患者通常表现出某些临床症状，如腹泻、腹部痉挛、低热和呕吐。各种毒力因子是这些临床症状的发病机制，包括热稳定直接溶血素(TDH)、TDH相关溶血素(TRH)、III型分泌系统(即T3SS1和T3SS2)、脂多糖和细胞外蛋白酶。

  检测海产品标本中的副溶血性弧菌致病菌株对食品安全和监测具有重要意义。然而并非所有副溶血性弧菌菌株都是致病性的，因此需要能够从非致病性环境菌株中特异性鉴定致病性副溶血性弧菌菌株的诊断分析。

  检测和鉴定食品中致病性副溶血性弧菌的传统培养方法既费力又耗时。多步骤程序涉及食品基质制备、富集、筛选、显微镜观察和生化测试，且易出现人为错误，并可能导致假阳性或假阴性数据。而基于聚合酶链式反应(PCR)的病原体检测方法是一种稳定的方法，以其对靶点的特异性、敏感性和更短的周转时间而闻名，广泛用于检测食源性病原体。此外，扩展多路复用方法可以用于高效和灵活地检测多个目标。PCR方法及其扩展修饰已被广泛用于从临床、环境和海鲜样本中鉴定致病性副溶血性弧菌。然而，常规PCR结果的可视化需要琼脂糖凝胶电泳步骤，对DNA结合染料进行染色和去染色，使整个检测过程长达24-48小时。尽管实时PCR技术已被开发用于在运行期间监测扩增，但该仪器相当昂贵，因此不适用于所有实验室。为了解决这个问题并简化诊断过程，已经开发了一种侧流尺(LFD)测定法，并将其与DNA免疫生物传感器测定法相结合。这种方法只需要10-15分钟，而琼脂糖凝胶电泳需要45-50分钟才能完成可视化。

  本研究旨在开发用于特异性检测致病性副溶血性弧菌菌株的快速多重PCR-LFD免疫生物传感器。这是首次将多重PCR和LFD检测相结合，利用不耐热溶血基因(TLH)和TDH基因识别和区分致病性副溶血性弧菌和非致病性菌株。其中，TLH作为一种磷脂酶发挥作用，只有在卵磷脂存在的情况下才能发现其溶血活性。在临床和环境分离株中均观察到该基因，因此它已被用作开发副溶血性弧菌检测方法的靶标。TDH基因标记物被用作副溶血性弧菌的致病标记物，因为超过80%的副溶血性弧菌临床菌株的基因组中含有该毒素基因。

  在本研究中，使用针对TLH和TDH基因的Biotin-、FAM-和Dig-共轭引物进行多重 PCR 扩增。通过琼脂糖凝胶电泳和侧流试纸对该方法条件进行了优化和评价。根据结果，使用的引物对没有显示出扩增效率的损失。重要的是优化退火条件，以避免任何非特异性扩增和由于多重PCR反应中两个引物对的相互作用而导致的低扩增效率情况。此外，这种PCR-LFD方法以前也被其他研究用于类似的目的，最适合在资源有限的环境中现场识别目标。

  已经报道了PCR技术及其改良方法的不同灵敏度。检测的不同极限可能是由于引物扩增效率、反应体积、扩增子大小、主混合物和可视化方法的差异。使用属于七种食源性病原体物种的菌株进行特异性测定，使用浓度范围为 0.39-100 ng/反应的 DNA 评估该方法的灵敏度。开发的多重 PCR-LFD检测法未显示非特异性扩增，尽管当前研究的检测限结果显示，通过琼脂糖凝胶电泳观察到的TLH+TDH+双阳性的检测限为0.78 ng(780 pg)，但当应用LFD测定时，检测限增加到0.39 ng(390 pg)。更高数量的扩增循环可用于进一步提高所开发方法的灵敏度，因为循环次数可高达35次，仍处于最佳范围。

  对于人工加标实验，富集4 h后，该方法可以检测出10¹ CFU/10 g虾样品中的TLH和TDH基因，将致病性副溶血性弧菌与冷冻虾产品中发现的环境背景副溶血性弧菌区分开来，与其他需要大约3–8小时浓缩期的工作相当。表明所开发的多重PCR-LFD测定具有较高的特异性和敏感性。

  总的来说，通过靶向TLH和TDH基因来检测和区分致病性副溶血性弧菌的多重PCR-LFD检测方法的性能和适用性令人满意，可以作为开发用于食品安全领域的检测试剂盒的有用工具。

  参考文献：Saetang, J.; Sukkapat, P.; Palamae, S.; Singh, P.; Senathipathi, D.N.; Buatong, J.; Benjakul, S. Multiplex PCR-Lateral Flow Dipstick Method for Detection of Thermostable Direct Hemolysin (TDH) Producing V. parahaemolyticus. Biosensors 2023, 13, 698. https://doi.org/10.3390/bios13070698