氧化石墨烯多重 qPCR 提高 SARS-CoV-2 检测灵敏度

  目前，逆转录定量聚合酶链反应(RT-qPCR)被认为是SARS-CoV-2检测的金标准。自 COVID-19 爆发以来，全球 RT-qPCR检测能力急剧增加，每天进行数百万次检测。然而，常规RT-qPCR仅能检测到71%的SARS-CoV-2感染，这可能是由于体内病毒载量低或临床采样不当导致检测灵敏度不足和样本浓度低所致。因此，传统的RT-qPCR不能充分满足筛查SARS-CoV-2感染的临床需求，并增加了潜在的传播风险。多重qPCR是基因表达和单核苷酸多态性分析中常用的检测方法。多重qPCR可同时检测不同的靶基因，但由于系统的复杂性和不同扩增反应之间可能存在的干扰，其在临床诊断中的应用较低。因此，需要一种新型或改进的高灵敏度多重 qPCR 系统来提高 SARS-CoV-2 检测的准确性。氧化石墨烯(GO)增强了常规PCR和单次qPCR检测结核病和卵巢癌的灵敏度。然而，GO在多重qPCR中的应用尚未见报道。由于多重qPCR含有多对引物，因此在扩增过程中容易产生引物二聚化或错配杂交，导致靶产物扩增效率降低。在GO多重qPCR中，将正向引物预先固定在GO表面，只有当目标片段与引物正确配对时，才会释放正向引物，这将减少引物错配的机会，从而提高GO-multiplex qPCR的灵敏度。

  GO是石墨烯的氧化衍生物，具有sp2具有六边形蜂窝结构的区域和 SP3与含氧官能团相连的碳基质区。sp2结构域使GO对芳香环具有亲和力和荧光猝灭能力。此外，附着在sp上的亲水基团3区域稳定水溶液中的GO。GO具有较大的表面积、出色的化学官能团和独特的界面性质，具有很强的单链DNA(ssDNA)吸附能力[17]。先前的研究表明，GO通过π-π堆积和氢键吸附ssDNA。基于这一特性，更多的研究证明了GO-single PCR在疾病诊断中的优异检测性能。

  研究提出了一种高灵敏度的 GO-多重 qPCR 方法，用于同时检测两个 SARS-CoV-2 基因(RdRP 和 E)和一个参考基因 (RNase P)。在GO多重qPCR系统中，GO在进入扩增系统之前预吸收每个正向引物以形成特定的GO正向引物复合物。靶基因扩增被限制在富含引物的复合材料中，从而提高了测定的灵敏度。与传统的多重 qPCR 相比，GO-多重 qPCR 可降低检测限。

  参考文献：Zeng, Y., Zhou, L., Yang, Z., Yu, X., Song, Z., & He, Y. (2022). High sensitivity SARS-CoV-2 detection using graphene oxide-multiplex qPCR. Anal Chim Acta, 1234, 340533.