单叠氮丙啶两轮处理完全抑制弯曲杆菌死亡细胞的定量PCR检测

  弯曲杆菌病是全球食源性细菌性腹泻的常见病因，禽肉是其主要来源。弯曲杆菌属可以在不合适的环境条件下以可存活但不可培养(VBNC)的状态下存在，因此，传统培养方法无法检测到它们。实时荧光定量聚合酶链反应(qPCR)可以用于对禽肉中的弯曲杆菌进行计数，但它也会扩增来自死细菌的DNA。而将单叠氮丙啶(PMA)与qPCR相结合，可以抑制死细菌的DNA扩增从而实现只计数活细菌。但是，在先前的研究中，PMA治疗在抑制死细胞检测方面的功效有所不同。这项研究旨在优化PMA治疗方法，以区分活细胞和死细胞，并开发一种有效的PMA-qPCR方法来检测鸡肉中包括VBNC细胞在内的活性弯曲杆菌。

  本文将PMA-qPCR用于检测鸡肉中包括VBNC细胞在内的活性弯曲杆菌，但在qPCR之前进行了两轮PMA处理，以完全抑制来自死细胞的DNA信号，而单次PMA处理并未能达到这种抑制作用。该研究使用了商用鸡肉样本，这些样本首先使用磷酸盐缓冲盐水(PBS)，再进行均质化并经过过滤以收集鸡汁以供下一步实验使用。使用优化的PMA-qPCR方法评估了鸡肉中弯曲杆菌属的检出率，并将结果与传统的培养方法进行了比较。

  优化的PMA-qPCR方法显示，与传统的基于培养的方法相比，弯曲杆菌属的检出率更高，尤其是在鸡肝样本中PMA与qPCR相结合，可有效抑制对死细胞的检测，从而可以选择性地检测出存活的弯曲杆菌。因此，该方法为检测鸡肉中存活的弯曲杆菌属(包括VBNC细胞)提供了一种更可靠、更有效的方法，这是基于培养的方法无法实现的。PMA-qPCR方法在灵敏度和特异性方面比基于培养的方法具有优势，因为它可以检测出基于培养的技术可能遗漏的活细菌。且PMA-qPCR方法可以更快、更准确地检测鸡肉中的弯曲杆菌，从而改善商用鸡肉产品的风险评估。

  结果表明：

  1. 优化的PMA-qPCR方法成功检测出鸡肉中存在的弯曲杆菌属，包括VBNC细胞，而使用传统的培养方法无法检测到这些曲杆菌。

  2.使用LIVEDEAD BacLight细菌活力试剂盒，活细胞的活力被证实为90%以上，而死细胞的存活率为0%。

  3.当使用PMA-qPCR和传统的培养方法比较鸡肉中弯曲杆菌属的检出率时，PMA-qPCR显示出更高的检出率，尤其是在鸡肝样本中。

  4.PMA-qPCR方法为检测存活的弯曲杆菌属提供了一种更可靠、更有效的方法，与基于培养的方法相比，其灵敏度和特异性有所提高。

  5.该研究表明，优化的PMA-qPCR方法可以通过准确检测包括VBNC细胞在内的活性弯曲杆菌属，来帮助对商用鸡肉进行可靠的风险评估。

  但是该方法也存在一定的局限性，即该研究没有提供有关PMA-qPCR方法与其他分子检测方法或替代方法相比的特异性和灵敏度的信息，也并未涉及样本矩阵或其他可能影响PMA-qPCR方法性能的因素的潜在影响。